Hazard assessment of single and mixed exposures to nanoplastics and caffeine on in vivo and in vitro models of Xenopus laevis

Abstract

Pollution is one of the major impacting drivers on wildlife populations, especially on amphibian´s due to their high susceptibility to xenobiotics. Plastic contaminants have been a target of extensive risk assessment research, mainly because of their environmental persistence. Polyhydroxybutyrate (PHB) is a bio-based and biodegradable polymer, that although regarded as non-toxic in medical related experimentations, its ecological impact has yet to be fully evaluated, particularly regarding its nano-sized particles (NPs). In addition to its individual exposure threat, nanoparticles may serve as vectors for chemicals, promoting its incorporation by biota. Caffeine is the world's most widely consumed psychoactive drug and a relevant representative of pharmaceutically active pollutants in surface water bodies. Amphibians are both prey and predators of freshwater ecosystems, playing a key role in population dynamics. Nonetheless there is a lack of knowledge regarding amphibians’ sensitivity to emerging to contaminants. This work comprises two main goals: (i) assess the individual and combined effects of caffeine and bioplastics (PHB-NPs) to early life stages of Xenopus laevis; (ii) determine the adequacy of in vitro assays as non-animal alternatives for first tiers of amphibian aquatic stages risk assessment. To achieve this, the toxicity of caffeine and PHB-NPs was assessed individually and in mixture, in 96-h assays with embryos and tadpoles of X. laevis, and in 72-h assays with A6 e XTC-2 cell lines of X. laevis. The present study provides the first experimental evidence of cytotoxic impact initiated by novel bio-nanoplastics and caffeine exposure, either as a single contaminant or in combination, to amphibian in vitro models. Caffeine proved strong effects on survivorship, malformations, heartbeat, and body growth, on both early life stages, while PHB-NPs displayed no toxicity on X. laevis. PHB-NPs and caffeine co-exposure displayed no apparent interaction on in vivo models, while on in vitro assays both examples of antagonism and synergism were observed. Embryos were consistently more sensitive than tadpoles to caffeine, with LC₅₀ of 196 and 226 mg/L, respectively. Live models were more susceptible to caffeine than both A6 (587 mg/L) and XTC-2 (864 mg/L) cell lines, while for PHB-NPs the opposite was observed. Even though PHB is regarded as a biodegradable and biocompatible polymer, our results indicate that PHB-NPs displayed cytotoxic potential. Thus, it is pivotal to further explore the effects of PHB-NPs on in vivo models, in order to better understand its suitability as an environmental-friendly alternative.

A poluição é um dos principais fatores que afetam as populações de vida selvagem, especialmente de anfíbios, devido à sua alta suscetibilidade a xenobióticos. Os contaminantes plásticos têm sido alvo de extensos estudos de avaliação de risco, principalmente devido à sua persistência em ecossistemas aquáticos e terrestres. O polihidroxibutirato (PHB) é um polímero biodegradável e de base biológica que, embora considerado como não tóxico em estudos de estatuto medicinal, o seu impacto ecológico ainda não foi totalmente avaliado, principalmente no que respeita às suas partículas de tamanho nanométrico (NPs). Para além da ameaça por exposição individual, as nanopartículas podem servir como vetores de contaminantes, promovendo a sua incorporação pela biota. A cafeína é a droga psicoativa mais consumida no mundo, assim como um relevante representante de poluentes farmaceuticamente ativos em corpos hídricos de superfície. Os anfíbios são predadores e presa em ecossistemas de água doce, desempenhando um papel importante na dinâmica destes ecossistemas. No entanto, existe uma falta de conhecimento em relação à sensibilidade dos anfíbios a contaminantes emergentes. Este trabalho compreende dois objetivos principais: (i) avaliar os efeitos individuais e combinados da cafeína e bioplásticos (PHB-NPs) nas fases iniciais da vida de Xenopus laevis; (ii) determinar a adequação de ensaios in vitro como alternativas não animais para os primeiros níveis de avaliação de risco de estágios aquáticos de anfíbios. Para tal, a toxicidade da cafeína e dos PHB-NPs foi avaliada individualmente e em mistura, em ensaios de 96 horas com embriões e girinos de X. laevis, e em ensaios de 72 horas com linhas celulares A6 e XTC-2 de X. laevis. O presente estudo fornece a primeira evidência experimental de efeitos citotóxicos, provocado por exposição singular e em mistura, de bio-nanoplásticos e cafeína em modelos in vitro de anfíbios. A cafeína induziu fortes efeitos na sobrevivência, malformações, batimentos cardíacos e crescimento corporal em embriões e girinos de X. laevis, enquanto as PHB-NPs não apresentaram toxicidade em X. laevis. A exposição a misturas de PHB-NPs e cafeína não apresentou uma interação aparente em modelos in vivo, enquanto que em ensaios in vitro foram observados exemplos de antagonismo e sinergismo. Os embriões foram consistentemente mais sensíveis que os girinos à cafeína, com LC₅₀ de 196 e 226 mg/L, respetivamente. Os modelos vivos foram mais suscetíveis à cafeína do que as linhas celulares A6 (587 mg/L) e XTC-2 (864 mg/L), enquanto que para PHB-NPs foi observado o oposto. Embora o PHB seja considerado um polímero biodegradável e biocompatível, os nossos resultados indicam que as PHB-NPs apresentam potencial citotóxico. Como tal, é fundamental continuar a investigação dos efeitos das PHB-NPs em modelos in vivo, assim de melhor entender e sua adequação como uma alternativa amiga do ambiente.