Study of the immune responses induced by Toxoplasma gondii membrane extract using the mice model

Abstract

Toxoplasma gondii (T. gondii) is an obligate intracellular parasite with a complex life cycle, capable of infecting warm-blooded animals. About one third of the world's population is infected, with immunocompetent individuals usually asymptomatic, while immunocompromised individuals may develop cerebral or ocular toxoplasmosis. T. gondii infection poses a great risk during pregnancy, leading to miscarriage or congenital toxoplasmosis, which can cause malformations in the foetus, mental retardation, or even premature death. At the present there is no vaccine for humans. Therefore, the development of a vaccine capable of preventing toxoplasmosis in humans is necessary. This work aims to study humoral and cellular immune responses induced by immunization with a membrane extract from tachyzoite forms of T. gondii Me49 strain able to induce protection against infection. BALB/c mice were immunised by intranasal route, using T. gondii membrane proteins (TGMP) and Class B oligonucleotides that contain unmethylated CpG dinucleotides motifs adjuvant (CpG ODN or only CpG ODN (control). To assess the ability to induce protection, blood and intestinal lavage fluids were collected from animals after immunisation, and the levels of TGMP-specific IgG1 and IgG2a, and IgA, respectively, were measured by ELISA. Parasite load was quantified in tissues of immunized animals by detection of Surface Antigen-1 (SAG-1) by qPCR. In order to characterise the cellular response, spleen and lung cells were analysed by flow cytometry to quantify the CD4⁺ and CD8⁺ T-lymphocytes, as well as the cytokines produced by them after specific and non-specific stimuli, with and without infection. The results obtained showed a significant increase in the levels of TGMP-specific IgG1 and IgG2a, as well as TGMP-specific IgA in the intestinal mucosa of animals immunised with TGMP plus ODN, compared with control animals. Parasite load was significantly decreased in the spleen and peritoneal exudate (PE) of animals immunised with TGMP plus ODN when compared with the control group. In the analyses of cellular responses, no significant differences could be observed between the groups of animals under the defined experimental conditions. In the cellular response analysis in response to TGMP plus ODN immunisation and after T. gondii infection, it is possible to observe an increase of non-specific TCD8⁺IFNγ⁺ spleen cells at short term (3 weeks after the 2nd immunisation with TGMP plus ODN) and 5 days after infection, and an increase of TGMP-specific TCD4⁺IFNγ⁺ in the lung at long term (9 weeks after the 2nd immunisation with TGMP and ODN) and 5 days after infection with T. gondii. We conclude that the immunisation protocol used induces a significant protection against infection at short and long term, associated with an increase of a specific Th1/Th2 humoral responses and a significant increase in the TCD4⁺IFNγ⁺ or TCD8⁺IFNγ⁺ cell populations, determinant in the protective response against T. gondii infection.

Toxoplasma gondii (T. gondii) é um parasita intracelular obrigatório com um ciclo de vida complexo, capaz de infetar animais de sangue quente. Cerca de um terço da população mundial está infetada, sendo os indivíduos imunocompetentes geralmente assintomáticos, enquanto os indivíduos imunocomprometidos podem desenvolver toxoplasmose cerebral ou ocular. A infeção por T. gondii representa um risco elevado durante a gravidez, levando ao aborto ou à toxoplasmose congénita, podendo esta causar malformações no feto, atraso mental, ou mesmo a morte prematura. Atualmente, não existe vacina para os seres humanos. Assim, é necessário o desenvolvimento de uma vacina capaz de prevenir a toxoplasmose nos seres humanos. Este trabalho visa estudar as respostas imunitárias humorais e celulares induzidas pela imunização com um extrato de membrana de taquizoítos da estirpe Me49, capaz de induzir proteção contra a infeção por T. gondii. Murganhos da estirpe BALB/c foram imunizados intranasalmente, utilizando proteínas de membrana de T. gondii (TGMP) e um adjuvante consistindo em oligonucleótidos de classe B com domínios estruturais contendo dinucleótidos CpG não metilados (CpG ODN), ou apenas CpG ODN (grupo controlo). Para avaliar a capacidade de induzir proteção, foram recolhidas amostras de sangue e fluidos de lavagem intestinal dos animais após a imunização. Os níveis de anticorpos específicos IgG1, IgG2a e IgA para TGMP foram quantificados por ELISA. A carga de parasitas foi quantificada nos órgãos de animais imunizados e infetados através da deteção do Antigénio de Superfície-1 (SAG-1) por qPCR. De modo a caracterizar a resposta celular, as células do baço e do pulmão foram analisadas por citometria de fluxo, de modo a quantificar os linfócitos T CD4⁺ e CD8⁺, assim como as citocinas por eles produzidas após estímulos específico (TGMP) e inespecífico. Os resultados obtidos mostram um aumento significativo dos níveis de IgG1 e IgG2a específica para TGMP, bem como dos níveis IgA na mucosa intestinal dos animais imunizados com TGMP e ODN, em comparação com animais controlo. A carga parasitária diminuiu significativamente no baço e no exsudado peritoneal (PE) de animais imunizados com TGMP e ODN quando comparados com o grupo controlo. Na análise da resposta celular à imunização com TGMP e ODN, não foi possível observar diferenças significativas entre os grupos de animais nas condições experimentais definidas. Na análise da resposta celular em resposta à imunização com TGMP e ODN e infeção com T. gondii é possível observar o aumento de TCD8⁺IFNγ⁺ inespecíficas no baço a curto prazo (3 semanas após a 2ª imunização com TGMP e ODN) e 5 dias após infeção, e um aumento de TCD4⁺IFNγ⁺ específicas para TGMP no pulmão a longo prazo (9 semanas após a 2ª imunização com TGMP e ODN) e 5 dias após infeção com T. gondii. Conclui-se assim que o protocolo de imunização utilizado induz uma proteção significativa contra a infeção a curto e a longo prazo, associada com um aumento das respostas especificas humorais Th1/Th2 e um aumento significativo das populações celulares TCD4⁺IFNγ⁺ ou TCD8⁺IFNγ⁺ determinantes na resposta protetora contra a infeção por T. gondii.