The crosstalk between miRNAs and tRNA modifying enzymes: an alternative pathway to regulate the tRNA epitranscriptome

Abstract

Non-coding RNAs, namely transfer RNAs (tRNAs) and microRNAs (miRNAs) are pivotal for accurate translation of mRNAs into proteins. tRNAs, the adaptor molecules of translation, carry several chemical modifications (tRNAMods). These are catalysed by tRNA modifying enzymes (tRME) and are crucial for translation accuracy and fidelity. Indeed, imbalances in tRNAMods and in tRME expression are found in cancer and neurological disorders. Although both imbalances in tRNAMods and in miRNA expression have been pinpointed as causes of translation impairments and pathogenesis there is a lack of studies exploring how and if miRNAs are recruited in response to tRNA hypomodification. Since miRNAs control gene expression post-transcriptionally, we hypothesize that impaired translation efficiency due to tRNAMods disruption leads to cellular translation reprograming through miRNA-regulated mechanisms. Taking advantage of preliminary data from the host group on -omics analysis of HeLA cells silenced for a specific tRME – ELP3, as well as sncRNA-Seq data in the same cell line, I started by performing data integration analysis to identify miRNA candidates that could play a role in the cellular response to tRNA hypomodification. This analysis revealed that ELP3 silencing led to decreased abundance of other tRME – TRMU, and that both enzymes were putative miR-1-3p targets. To experimentally validate these findings, ELP3 and TRMU expression was challenged and their expression levels, as well as miR-1-3p levels, were quantified. Additionally, cells were transfected with miR-1-3p mimics and miRNA inhibitors and ELP3 and TRMU mRNA and protein expression was assessed, as well as other relevant factors, namely protein aggregation levels, and the unfolded protein response. Binding of miR-1-3p to the 3’UTR of ELP3 was tested and validated with Dual reporter Luciferase assays. This thesis shows that tRNAME enzyme disruption, and consequently tRNAMod imbalances, influence miRNA expression and that, in turn, miRNA dysregulation impacts tRNAME expression. These results provide the first evidences of a crosstalk between miRNAs and tRNA epitranscriptome modulation, demonstrating that miRNAs can also be used to predict tRNA modification levels and may represent promising targets to promote tRNA modification reprograming in conditions where those epitranscriptomic marks are affected, namely conformational disorders or cancer.

Os RNAs não codificantes, nomeadamente os RNAs de transferência (tRNAs) e os microRNAs (miRNAs) são fundamentais para a tradução precisa dos RNAs mensageiros em proteínas. Os tRNAs, as moléculas adaptadoras da tradução, transportam várias modificações químicas (tRNAMods). Estas são catalisadas por enzimas modificadoras de tRNA (tRME) e são cruciais para a exatidão e fidelidade da tradução. De facto, os desequilíbrios em tRNAMods e na expressão do tRME são encontrados no cancro e nas perturbações neurológicas. Embora ambos os desequilíbrios em tRNAMods e na expressão do miRNA tenham sido apontados como causas de deficiências de tradução e patogénese, existem poucos estudos que explorem como e se os miRNAs são recrutados em resposta aos tRNAs hipomodificados. Uma vez que os miRNAs controlam a expressão genética após a transcrição, colocamos a hipótese de que a eficiência da tradução, uma vez prejudicada devido à perturbação dos tRNAMods, leva à reprogramação da tradução celular através de mecanismos regulados por miRNAs. Aproveitando os dados preliminares do grupo de investigação sobre expressão genética e análise proteómica de células HeLa silenciadas para uma tRME específica - ELP3, bem como dados sncRNA-Seq na mesma linha celular, comecei por realizar análises de integração de dados para identificar miRNAs que poderiam desempenhar um papel na resposta celular à hipomodificação do tRNA. Esta análise revelou que o silenciamento ELP3 leva a uma diminuição da abundância de outras tRME - TRMU, e que ambas as enzimas eram alvos putativos do miR-1-3p. Para validar experimentalmente estas descobertas, a expressão da ELP3 e TRMU foi manipulada, e os níveis de expressão assim como os níveis de miR-1-3p, foram quantificados. Adicionalmente, as células foram transfectadas com um mimetizador do miR-1-3p e com inibidores desse miRNA e a expressão da ELP3 e TRMU foi avaliada, bem como outros fatores relevantes, nomeadamente os níveis de agregação de proteínas. A ligação do miR-1-3p à 3'UTR da ELP3 foi testada e validada com ensaios de Luciferase. Esta tese mostra que a perturbação de tRNAME, e consequentemente os desequilíbrios de tRNAMod, influenciam a expressão de miRNAs e que, por sua vez, a desregulação de miRNAs tem impacto na expressão de tRNAMEs. Estes resultados fornecem as primeiras evidências de uma correlação entre a expressão de miRNAs e a modulação das modificações de tRNAs, demonstrando que os miRNAs podem representar alvos promissores para promover a reprogramação do epitranscriptoma do tRNA, o que pode ser relevante em doenças conformacionais ou cancro.