Subpopulações de linfócitos humanos: alterações causadas por agentes imunodepressores em doentes receptores do enxerto cardíaco

Abstract

Existe actualmente grande indefinição e controvérsia relativamente à demarcação de populações linfocitárias do sangue periférico humano que resultam fundamentalmente de pequenas divergências de protocolos utilizados em diferentes laboratórios. Foi dentro deste âmbito que desenvolvemos estudos com vista à identificação e determinação do grau de intercepção das diferentes populações linfocitárias. Para tal empregámos técnicas comummente utilizadas - testes de marcação simples e de Destituição Celular (DC) - e uma técnica por nós previamente desenvolvida (Carvalho, 1983) de marcação dupla - Reacção de Roseta Mista (RRM). Para identificação de (i) linfócitos B, (ii) linfócitos T, (iii) linfócitos possuidores do antigénio Ia (células Ia⁺) e (iv) linfócitos apresentando a cadeia leve K da imunoglobulina (celulas C⁺) usámos testes de Reacção de Roseta Antiglobulina (ou anti-determinante) Directa - RRAD ou RRAdD - utilizando, respectivamente, (i) imunoglobulina anti-Fab humana, (ii) anticorpo monoclonal (AcMc) contra determinante antigénio presente em linfócitos T humanos, (iii) AcMc contra o antigénio Ia humano e (iv) AcMc contra a cadeia leve K humana. Os linfócitos possuidores de receptores para a porção Fc da IgG foram detectados pela reacção de roseta EA, usando eritrócitos de Boi sensibilizados com anticorpo específico, IgG purificada. Os testes simples indicaram que da população total de linfócitos sanguíneos, 75,1± 5,3% (média± DPM) (n=76) eram células T; 19,4±6,4% (n=97) eram células B; 13,8±6,1% (n=21) expressavam a cadeia K; 15,6±7,6% (n=66) possuíam o antigénio Ia; e 22,6±3,3% (n=21) expressavam 207 receptores para Fcᵧ. Dos testes de marcação dupla pudemos concluir que não existe uma separação perfeita entre linfócitos B e linfócitos T, pois observámos que da totalidade de linfócitos sanguíneos 5,0±3,7% (por DC) ou 3,9±2,7% (por RRM) possuíam ambos os marcadores de linfócitos B e de T. Verificámos também que da totalidade de linfócitos B do sangue periférico, (i) 32,76±22,99% (por DC) ou 22,58±18,26% (por RRM) possuíam o antigénio dos linfócitos T; (ii) 65,96±6,40% (por RRM) eram portadores da cadeia leve K; (iii) 42,27±27,11% (por DC) ou 61,30±24,30% (por RRM) possuíam o antigénio la; e (iv) 74,33±13,00% (porRRM) apresentavam receptores para a porção Fc da IgG. Do mesmo modo, da totalidade de linfócitos T registámos que (i) 6,26±4,42% (por DC) ou 5,28±3,58% (por RRM) possuiam Ig de superfície; (ii) 2,73±2,08% (por RRM) apresentavam a cadeia K; (iii) 4,12±2,36% (por RRM) expressavam o antigénio Ia; e (iv) 6,10±3,09% (por RRM) possuíam receptores Fcᵧ. Com base nos valores obtidos construímos um modelo bidimensional que permite visualizar a interrelação das diversas subpopulações linfocitárias, facilitando assim a interpretação e discussão dos resultados. Observámos alterações nas proporções das subpopulações de linfócitos humanos em culturas in vitro após estimulação mitogénica (fitohemaglutinina, PHA) alogénica (cultura mista de linfócitos, MLC) ou viral (MLC com linfócitos autólogos transformados por vírus Epstein-Barr). O aumento de células Ia⁺ foi apreciável (de <20% atingiram 40-60% da totalidade de linfócitos) e resultou da notável elevação da proporção de linfócitos T que adquiriram o antigénio Ia (de <5% atingjram 50-60% dos linfócitos T). Alterações das subpopulações linfocitárias em doentes receptores de enxerto cardíaco, mantidos sob tratamento imunodepressor, constituiu objecto de estudo pormenorizado. Em doentes que haviam sido submetidos a transplantação há mais de um ano e que recebiam tratamento diário de predenisona e azatioprina, observámos um decréscimo acentuado do número de linfócitos constituintes de cada subpopulação linfocitária tendo sido a população de células T a mais afectada, apresentando uma redução de 90,72% relativamente ao controlo normal. Em termos de valores percentuais a população T sofreu uma redução significativa (56,66±13,02%) em relação ao controlo normal (75,11±5,29%). Pelo contrário, as células TIa⁺ apresentavam-se significativamente mais elevadas (9,16±8,62%) do que em indivíduos normais (3,40±2,20%). A administração de globulina anti-timócito (GAT) aos doentes durante os 10 dias imediatamente após a operação de transplantação, causou um decréscimo ainda mais acentuado do número de células constituintes das diversas subpopulações linfocitárias. Foi também a população T a que sofreu redução mais acentuada em termos percentuais, enquanto que as subpopulações TIa⁺ e TFcᵧ⁺ aumentaram a sua proporção. Em doentes imunodeprimidos com ciclosporina A e predenisona observámos no período de dois a cinco meses após transplantação cardíaca o surgimento de infecções por herpesvírus. Durante a infecção observámos uma redução de linfócitos T e um proporcional aumento de linfócitos B; os elevados níveis de células TIa⁺ encontrados foi devido à elevação da proporção de linfócitos T a expressarem o antigénio Ia. Os picos de células TIa⁺ relacionavam-se com a infecção primária por citomegalovirus ou com a reactivação por vírus Epstein-Barr ou por vírus do herpes simples; aqueles picos formaram-se antes da produção máxima de IgM e IgG anti-viral e sofreram regressão com a administração intravenosa de metilpredenisolona ou transfusão sanguínea. Pelo contrário, a produção de anticorpos não foi sensível a tais tratamentos. Não encontrámos correlação entre o desenvolvimento de células TIa⁺ e a rejeição de enxerto. Estes resultados indicam que o tratamento imunodepressor administrado aos doentes receptores de enxerto cardíaco não impede o desenvolvimento de mecanismos celulares e humorais capazes de superar as infecções por herpesvírus. Do presente estudo podemos concluir que as populações linfocitárias humanas não formam compartimentos perfeitamente estanques, e que o aumento ou redução da expressão de receptores e/ou antigénios, como resultado da resposta imunológica dos linfócitos, evidencia a natureza dinâmica e mutável das populações linfocitárias.

There is some controversy concerning the specificity of membrane markers identifying lymphocyte subpopulations in human peripheral blood. In this work, lymphocyte subpopulations and the level of over lap in their markers was studed by single marker tests, Cell Depletion (CD) and by double marker assays. Mixed Rosetting Reactions (MRR), were done as described earlier in a M.Sc. thesis (Carvalho, 1983). These analyses were done on healthy and immunosuppressed heart transplant recipients. Direct antiglobulin (or antideterminant) rosetting reactions were used to identify (i) B lymphocytes, (ii) T lymphocytes, (iii) lymphocytes exhibiting Ia antigens (Ia+ cells) and (iv) lymphocytes expressing the K chain of immunoglobulin (Ck⁺ cells) using, respectively, (i) a sheep IgG anti-human Fab immunoglobulin, (ii) a rat monoclonal antibody (McAb) to a human T cell antigen, (iii) a rat McAb to the moromorphic portion of human Ia antigen, and (iv) a mouse McAb to human K light chain of immunoglobulin. Lymphocytes exhibiting receptors for the Fe portion of IgG were detected by EA rosetting reaction, using ox erythrocytes sensitized with lgG purified specific antibody. Of the total blood lymphocyte population, single marker tests showed that 75.1±5.3% (n=76) were T cells, 19.4±6.4% (n=97) were B cells, 13.8±6.1% (n=21) expressed the K chain molecule, 15.6±7.6% (n=66) exhibited the Ia antigen, and 22.6±3.3% (n=21) expressed Fcᵧ receptors. Double tests indicated that B and T lymphocytes did not form absolutely distinct lymphocyte populations since 5.0±3.7% (by CD) or 3.9±2.7% (by MRR) of total lymphocytes expressed both surface lg and the T marker. Of the total peripheral blood B lymphocytes, (i) 32.76±22.99% (by CD) or 22.58±18.26% (by MRR) exhibited the T antigen, (ii) 65.96±6.40% (by MRR) expressed the K light chain, (iii) 42.27±27.11% (by CD) or 61.30±24.30% (by MRR) expressed the Ia antigen, and (iv) 74.33±13.00% (by MRR) exhibited Fcᵧ receptors. Similarly, of the total T lymphocytes, (i) 6.26±4.42% (by CD) or 5.28±3.58% (by MRR) showed surface Ig, (ii) 2.73±2.08% (by MRR) expressed the K light chain, (iii) 4.12±2.36% (by MRR) exhibited the Ia antigen, and (iv) 6.10±3.09% (by MRR) showed receptors for the Fcᵧ portion of IgG. Based on the degree of overlap between each pair of lymphocyte populations I drew a two-dimensional model which permits to visualize the interrelationship of the various lymphocyte populations. Alterations of the proportions of lymphocytes expressing Ia antigen were observed in in vitro cultures following mitogenic (phytohaemagglutinin, PHA), allogeneic (mixed lymphocyte culture, MLC) or viral (MLC with Epstein-Barr virus transformed autologous lymphocytes) stimulations. Significant increases in Ia⁺ cells (from 20% up to 40-60% of total lymphocytes) were observed and resulted from an increase of the proportion of T cells that acquired the Ia antigen (from 5% up to 50-60% of T lymphocytes). Alterations of lymphocyte subpopulations of heart transplant recipients, maintained under immunosuppressive therapy, was studied in detail. Patients who received a graft one year or more before and were receiving a daily treatment of prednisolone and azathioprine showed a drastic decrease of all lymphocyte subpopulations in which the T cell was the most affected one, exhibiting a decrease of 90.72% in absolute numbers. In percentage, T cells showed a significant reduction (56.66±13.02% as compared with 75.11±5.29% in normals). In contrast, TIa⁺ cells were significantly higher (9.16±8.62%) than in normal persons (3.40±2.20%). Antithymocyte globulin (ATG) administration during the first 10 days following the transplantation caused an even more profound decrease, in absolute numbers, of all lymphocyte subpopulations. The proportion of the T cell population was very reduced whereas both TIa⁺ and TFcᵧ marked cells increased their proportions: from about 4% to 50% and from about 6% to 60%, respectively. In patients immunosuppressed with cyclosporin A and prednisone I observed, in the period from two to five months post-transplantation, infections with herpesviruses. During infections (particularly by cytomegalovirus, CMV) there was a lower percentage of T cells with proportional increase in B cells: the high levels of Ia⁺ cells was mainly due to the expression of Ia antigens on T lymphocytes. Peaks of TIa⁺ cells were associated with primary CMV infection and reactivation of Epstein-Barr virus. Activated TIa⁺ cells appeared before the maximal IgM and IgG anti-viral titres. Intravenous methylprednisolone and blood transfusions selectively reduced TIa⁺ cell numbers but CMV-specific antibody titres were not affected by these treatments. No correlation was found between the levels of TIa⁺ cells in the blood and graft rejection episodes. These results suggest that the immunosuppressive treatment given to heart transplant recipients does not impede the activation of cellular and humoral responses to these herpesvirus infections. From the present study it was concluded that the markers used to delineate human lymphocyte subpopulations are not exclusive to these subpopulations, and that an increase or reduction in the expression of these receptors and/or antigens, as a result of the immune response of lymphocytes, shows the dynamic nature of lymphocytes.