Avaliação do comportamento de Brettanomyces bruxellensis ao longo da cadeia de produção do vinho

Abstract

A produção de vinho é uma das tecnologias mais antigas da humanidade, sendo atualmente considerada um dos processos biotecnológicos mais próspero ao nível comercial. O vinho surge de diversas reações bioquímicas, que se iniciam durante a maturação da uva e se estendem até ao engarrafamento, sendo os processos mais importantes na sua produção, as fermentações alcoólica e malolática, levadas a cabo por leveduras e bactérias lácticas, respetivamente. Uma das maiores preocupações na Enologia é o problema de instabilidade causado por leveduras presentes no vinho, sendo denominadas leveduras de alteração. A espécie Brettanomyces bruxellensis, uma das leveduras de alteração é a maior causa de contaminação de vinhos tintos em todo o mundo e a responsável por diversas perdas económicas na indústria do vinho devido à sua capacidade de produzir etilfenóis, tais como o 4-etilfenol e 4-etilguaiacol, responsáveis pelo aroma a “suor de cavalo”, indesejado pelo consumidor. Face a esta ocorrência nos vinhos, recorrem-se a metodologias que permitam a deteção e quantificação de B. bruxellensis, na indústria alimentar, sendo o mais recorrente para a análise de vinhos o cultivo em meio seletivo. No entanto, os métodos clássicos de microbiologia, como cultura em placa ou a visualização de características morfológicas, como a observação microscópica não são suficientes por si só para a identificação de B. bruxellensis, daí que tenham de ser combinados com outras técnicas tais como técnicas de identificação molecular e PCR. O intuito deste trabalho foi a deteção e quantificação de B. bruxellensis em todo o processo de vinificação, e a avaliação de técnica enológicas que permitam o controlo da presença da levedura no vinho. Sendo assim, as amostras de uvas, vinhos e algumas águas de enxaguamento após higienização foram analisados pelos métodos, clássico de cultivo em meio seletivo e moleculares, a PCR e qPCR. A análise clássica apresentou uma baixa reprodutividade na multiplicação da levedura em meio seletivo e por vezes não foi observado crescimento microbiano, que pode ser interpretado como ausência de B. bruxellensis na amostra, ou como um falso negativo, pois a levedura em certas condições ambientais poderá encontrar-se no estado viável, mas não cultivável. A PCR e qPCR permitiram detetar e quantificar, respetivamente, a presença da levedura de interesse que nem sempre era detetada usando os métodos clássicos. Observou-se a presença de B. bruxellensis, na maior parte das amostras de uvas, vinhos e águas de higienização, pela técnica PCR e foram quantificadas pela qPCR de modo a determinar a concentração de levedura presente, que foi calculada a partir de uma reta de calibração traçada com padrões de concentrações conhecidas de B. bruxellensis. Após ter sido determinada a concentração da levedura, em todas as amostras, verificou-se que uma amostra de vinho possuía uma concentração de aproximadamente 1,37 x 10⁵ UFC/mL, encontrando-se assim na ordem de grandeza 10⁵ UFC/mL, que corresponde, aproximadamente, à concentração mínima de B. bruxellensis necessária para dar origem ao carater “Brett” ao vinho, sendo, portanto, considerado como defeito. Todas as restantes amostras de vinho e uvas apresentaram concentrações de B. bruxellensis, abaixo de 10⁵ UFC/mL.

Wine production is one of the oldest technologies in humanity, being one of the most prosperous biotechnological processes at the commercial level. The wine arises from several biochemical reactions, which begin with the maturation of the grape and extend to bottling, being the most important process in its production, alcoholic fermentation, and malolactic fermentation, conducted by yeasts and lactic bacteria, respectively. One of the major concerns in Oenology is the problem of instability caused by yeasts present in wine, called altering yeasts. Brettanomyces bruxellensis, one of the yeasts of alteration is the largest cause of contamination of red wines worldwide and responsible for several economic losses in the wine industry due to its ability to produce ethylphenols, such as 4-ethylphenol and 4-ethylguaiacol, responsible for the aroma of "horse sweat", unwanted by the consumer. Due to this occurrence in wines, methodologies are being used to allow the discovery and quantification of Brettanomyces bruxellensis in the food industry, being the most used for the analysis of wines the plate culture. However, classical methods, such as plate culture or visualization of morphological characteristics, such as microscopic observation, are not sufficient when performed alone for the identification of B. bruxellensis, so they must be combined with other techniques such as molecular identification, and PCR. The objective of this study was the detection and quantification of B. bruxellensis throughout the winemaking process, and to evaluate oenological technologies which would allow a better control of this yeast in wine. Thus the samples from grapes, wines and rinsing water after hygienization were analyzed by the classical method, culture in a selective medium and by molecular methods such as PCR and qPCR. The classical method revealed low reproducibility of the yeast growth and mostly, it was not observed any growth whatsoever, which can be interpreted as absence of B. bruxellensis in the sample or as a false negative, due to this yeast being able to, under certain circumstances, undergo a state of viable but no culturable. The PCR and qPCR techniques allow the detection and quantification, respectively, of B. bruxellensis, that not always was detected in the classical method. It was observed the presence of B. bruxellensis, in most of the samples of grapes, wine and hygienization water, through PCR and they were quantified by qPCR, to determine the concentration of the yeast present, which was calculated by a calibration curve, determined by known concentrations of B. bruxellensis After the concentration of B. bruxellensis was determined in all samples it was observed that one wine sample had, approximately, a concentration of 1,37 x 10⁵ UFC/mL, being in an order of magnitude of 10⁵ UFC/mL, which is the minimum concentration of B. bruxellensis necessary to induce the “Brett” character to wine, considered as defect. All the remaining samples showed concentrations of B. bruxellensis, bellow 10⁵ UFC/mL.