Optimization of fermentation strategies for the production of a glycosphingolipid precursor

Abstract

Glycosphingolipids (GSLs), constituted by a glycan moiety and a ceramide tail, play crucial roles in the development, regulation, and maintenance of cell functions. Phytosphingosine is a sphingoid base that is part of the GSLs ceramide and can be produced through fermentation by the yeast Wickerhamomyces ciferrii, that naturally secretes acetylated phytosphingosines. The expensive carbon source, pure glycerol, used in these fermentations can be replaced by an economic alternative, such as crude glycerol from the biodiesel industry, although it may contain impurities that negatively affect fermentation. W. ciferrii requires nutrient-rich concentrated media, that can lead to saturation and formation of undesired precipitates, like struvite, an orthophosphate mineral formed by the ions Mg²⁺, NH₄⁺ and PO₄³⁺, which may negatively affect fermentation. This internship was developed at CarboCode, a company whose core activity is the production of GSLs to apply in cosmetics, food, and pharmaceutical markets. This project aimed to optimize the standard CarboCode fermentation, that uses the yeast W. ciferrii, by avoiding struvite precipitation in the fermentation, and by replacing the carbon source, pure glycerol, to reduce costs. To avoid struvite, precipitations tests were performed, followed by shake flask fermentations assays, where the addition of sodium hexametaphosphate (SHMP) to CarboCode medium proved to be the most promising solution, as it successfully chelates with Mg²⁺, preventing struvite formation. A more efficient fermentation was promoted, as xxx g L⁻¹ of product were achieved, result that outperformed the standard assay with xxx g L⁻¹. In a bioreactor, the pH reduction of the standard assay was evaluated, which also allowed to avoid struvite precipitation, however considering the standard assay where xxx g L⁻¹ of product were attained, there was no improvement in the results. To reduce the carbon source cost, crude glycerol samples from Biodiesel companies were tested, from which the most promising one was from Iberol. This sample allowed a higher reduction of the cost of the carbon source (88 % at bioreactor scale), and fermentation results of xxx g L⁻¹ and xxx g L⁻¹ of product were achieved in shake flask and bioreactor, respectively. This proved that crude glycerol is a viable carbon source and its impurities do not have a negative effect in the fermentation. In conclusion, to further understand the impact of SHMP as a chelating agent in the fermentation, bioreactor assays must be performed, and a crude glycerol from the company Iberol was considered an alternative carbon source in CarboCode fermentations.

Os glicoesfingolípidos (GSLs), constituídos por um monossacarídeo ou oligossacarídeo e uma ceramida, têm papéis essenciais no desenvolvimento, regulação e manutenção de funções celulares. A base esfingoide, fitoesfingosina, está presente na ceramida do GSLs e pode ser obtida através de fermentação usando a levedura Wickerhamomyces ciferrii, que produz naturalmente bases de fitoesfingosina acetiladas. O glicerol puro, fonte de carbono dispendiosa, usado neste tipo de fermentações, poderá ser substituído por uma alternativa mais económica como o glicerol bruto proveniente da indústria do biodiesel, todavia, este pode conter impurezas que influenciem negativamente a fermentação. A levedura W. ciferrii necessita de meios de cultura ricos em nutrientes que podem atingir a saturação levando à formação de precipitados indesejados, como a estruvite, um ortofosfato mineral formado pelos iões Mg²⁺, NH₄⁺ e PO4₄³⁺, afetando negativamente a fermentação. Este estágio foi desenvolvido na CarboCode, empresa cuja atividade chave é a produção de GSLs a fim de os aplicar nos mercados de cosméticos, alimentares e farmacêuticos. Neste sentido, este trabalho visou otimizar a fermentação padrão desta empresa que usa a levedura W. ciferrii, tendo dois objetivos principais, evitar a formação da estruvite no meio de fermentação e, a substituição da fonte de carbono, o glicerol puro, com vista à redução dos custos. A fim de evitar a estruvite, realizaram-se testes de precipitação, seguidos de ensaios de fermentação em Erlenmeyer, onde a adição de sódio hexametafosfato (SHMP) ao meio padrão da CarboCode comprovou ser a solução mais promissora, uma vez que este complexa com sucesso com o ião Mg²⁺, prevenindo a formação de estruvite. Obteve-se uma fermentação mais eficiente, dado que foram obtidos xxx g L⁻¹ de produto, resultado que superou o obtido no ensaio padrão da CarboCode, xxx g L⁻¹. Em biorreator foi avaliada a redução do pH do ensaio padrão o que também permitiu evitar a formação de estruvite, contudo, relativamente ao ensaio padrão onde se obteve xxx g L⁻¹ de produto, não houve melhoria de resultados. Para reduzir o custo da fonte de carbono, foram testadas amostras de glicerol bruto de empresas da indústria do Biodiesel, das quais a mais promissora foi a da empresa Iberol. Esta proporcionou a maior redução do custo da fonte de carbono (88 % para o biorreator) e resultados de fermentação mais promissores, quando comparados com o padrão, uma vez que foram obtidos xxx g L⁻¹ e xxx g L⁻¹ de produto em Erlenmeyer e biorreator, respetivamente. Ficou assim comprovado que o glicerol bruto foi uma fonte de carbono viável e que as suas impurezas não afetaram negativamente a fermentação. Em conclusão, para compreender melhor o impacto do SHMP como agente quelante na fermentação, devem fazer-se ensaios em biorreactor, e o glicerol bruto da empresa Iberol foi considerado uma fonte alternativa de carbono nas fermentações da CarboCode.