Environmentally safer plant protection products

Abstract

The widespread use of Plant Protection Products (PPPs) has been linked to negative impacts on the environment and human health. Thus, the development of safer PPP formulations is a current concern and a regulatory requirement. In this context, this thesis aims to shed a new light on the reformulation of PPPs as a valuable pathway to develop environmentally safer yet effective alternatives. This reformulation regards changes on the composition, type of formulation, and/or respective application rates of the products. Two major problems were identified to define this overarching aim: (1) the mixture of PPP active ingredients (AIs) seems not to be tested in a systematic way, in order to identify effective combinations that may be less harmful to the environment (e.g. synergistic action of AIs against non-target organisms is undesired; antagonistic action of AIs against target pests or weeds is not effective and imply the application of high amounts of toxicants in the field); (2) the environmental implications of more recently adopted types of formulations such as those involving the microencapsulation of the AIs are largely unknown. Therefore, the possibility of optimizing the formulation and application rates of the AIs of two selected commercial products (an herbicide and a fungicide) was addressed in the first part of this thesis. Additionally, a potential threat of encapsulated formulations to soil biota, by affecting the chemotaxis behavior response, along with other biological effects (lethality and reproduction were also assessed) was investigated in the second part. The nemtode species Caenorhabditis elegans was therein selected to comparatively assess the effects of non-encapsulated vs. encapsulated forms of the insecticide esfenvalerate. Opportunely, the potential of this model organism to be extensively used in environmental studies, particularly in the risk assessment of PPPs, was explored. In addition to a literature review, this approach also included a multi-level study evaluating the effects of the insecticide methomyl in C. elegans. Concerning the first part of the thesis, non-target and target organisms of selected PPPs were exposed to alternative ratio and rates of the herbicide/fungicide AIs and to the commercial formulations themselves for comparative effects and mixture interactions. Results showed that application rates of the herbicidal AIs (terbuthylazine and bentazone) as recommended in the commercial formulation compromised the growth of the non-target terrestrial plant Brassica napus, suggesting a remarkable potential risk to soil ecosystems. Importantly, 10-fold lower application rates effectively controlled the growth of the target weed Portulaca oleracea concomitantly reducing the negative impact on non-target species. Furthermore, an alternative formulation composed of only bentazone would be environmentally safer than the commercially employed two-way formulation and yet effective. In addition, the applied mixture and rates of the AIs tebuconazole and azoxystrobin, as used in the commercial fungicide, were generally found safe to the environment, but ineffective against two target fungal species (Pyrenophora teres and Rynchosporium secalis). None of the tested ratio/rates, including much higher rates than recommended, effectively controlled fungi growth, suggesting that this type of fungicide formulation is probably not the most advantageous to control those pests. Overall, results indicate that a more systematic testing of pesticide formulations as conducted in this thesis, namely concerning the evaluation of ingredient interactions, safety to non-targets, actual efficacy against targets, as well as application rates, can contribute to optimize (increase) their environmental safety and effectiveness. Preceded by a critical review on the potential of C. elegans as a relevant model for ecotoxicological assessment, the neurotoxicity and developmental effects of the insecticide methomyl were effectively assessed using this model by a multi-level approach (behavior and biometry, biochemical alterations and neurodegeneration) in the second part of the thesis; a computer tracking method and a GFP-tagged transgenic strain for cholinergic system were used to assess behavioral and biometrical effects, and neuronal damage, respectively. Results highlighted the effects of methomyl on C. elegans movement and development were transient and did not result in neurodegeneration in cholinergic neurons. Following a comprehensive review of protocols that can be used to assess chemotaxis behavior in C. elegans, effects of non-encapsulated vs. encapsulated forms of the insecticide esfenvalerate were compared in this model. The organism was very tolerant to short exposures of esfenvalerate at both forms regarding lethality and reproduction, since no significant effects were recorded. Distinctly, taxis-to-food behavior was apparently affected by the occurrence of the non-encapsulated form at the lowest tested concentration, both directly mixed with the bacterial food or in a nearby area. Remarkably, that interference on the worm ability to locate food did not occur when esfenvalerate was encapsulated. Given that chemosensation is a key behavioral response affecting the survival of multicellular organisms, results highlight the importance this endpoint might have in ecotoxicological assessment of pesticides. In addition, the safety of encapsulated formulations can be questioned based on current data. While at a first glance encapsulated formulations may have a protective role by preventing chemotaxis behavioral effects, capsules may work as a “poisoned candy” in case of incorporation by the organisms. This reinforces the need of more research assessing the potential risk of these type of formulations to soil biota. In this context, the “nobelized” C. elegans that has allowed to make incredible advances in developmental biology and neurobiology might also very valuable in environmental studies, namely in the assessment of the PPP impacts.

O uso generalizado de produtos fitofarmacêuticos (PFs) tem vindo a ser associado a impactos negativos, tanto no ambiente como na saúde humana. Assim, o desenvolvimento de formulações de PFs cada vez mais seguras é não só uma preocupação atual, mas também uma exigência regulatória. Neste contexto, esta tese visa contribuir com novo conhecimento acerca da reformulação de PFs como um caminho valioso para o desenvolvimento de alternativas ambientalmente mais seguras, ainda que a eficácia contra pestes-alvo seja assegurada. Esta reformulação contempla alterações na composição, tipo de formulação e/ou respetivas taxas de aplicação dos produtos. Dois problemas essenciais foram identificados na definição deste objetivo abrangente: (1) a mistura de ingredientes ativos (IAs) dos PFs não parece ser testada de forma sistemática, de modo a identificar combinações eficazes que possam ser o menos prejudiciais possível para o meio ambiente (por exemplo, a ação sinergística de IAs contra organismos não-alvo é indesejada; da mesma forma, uma ação antagonística contra pestes-alvo não é efetiva e implica uma maior aplicação de tóxicos no ambiente); (2) as consequências ambientais de tipos de formulações mais recentemente adotadas, como é o caso da microencapsulação dos IAs, são amplamente desconhecidas. Desta forma, a possibilidade de se otimizarem a formulação e as taxas de aplicação dos IAs de dois produtos comerciais selecionados (um herbicida e um fungicida) foi abordada na primeira parte desta tese. Adicionalmente, a potencial ameaça de formulações encapsuladas para a biota do solo, através de efeitos ao nível da resposta comportamental de quimiotaxia, juntamente com outros efeitos biológicos (efeitos na letalidade e reprodução foram também avaliados) foi investigada na segunda parte. O nematode Caenorhabditis elegans foi a espécie modelo selecionada para a avaliação comparativa de efeitos de uma forma não-encapsulada vs. encapsulada do inseticida esfenvalerato. Oportunamente, o potencial deste organismo modelo para ser amplamente utilizado em estudos ambientais, particularmente na avaliação de risco de PFs, foi adicionalmente explorado. Para tal, além de uma revisão da literatura, um estudo multinível, onde se avaliaram os efeitos do inseticida metomil em C. elegans, foi também incluído nesta abordagem. Na primeira parte da tese, organismos não-alvo e alvo dos PFs selecionados foram expostos a taxas de aplicação e rácios alternativos dos IAs destes produtos, um de ação herbicida e outro de ação fungicida, assim como às próprias formulações comerciais, para avaliação comparativa de efeitos e interações em mistura. Os resultados mostraram que as taxas de aplicação dos IAs com ação herbicida (terbutilazina e bentazona), como recomendado na formulação comercial, comprometeram o crescimento da planta terrestre não-alvo Brassica napus, sugerindo um potencial risco para os ecossistemas terrestres. É importante também ressalvar que taxas de aplicação 10 vezes inferiores controlaram efetivamente o crescimento de uma erva daninha alvo (Portulaca oleracea), reduzindo concomitantemente o impacto negativo sobre espécies não-alvo. Além disso, uma formulação alternativa composta apenas por bentazona seria eficaz e ambientalmente mais segura do que a que combina os dois IAs. Adicionalmente, a mistura e as taxas de aplicação dos IAs tebuconazol e azoxistrobina, como usado no fungicida comercial, foram geralmente seguras para o meio ambiente, mas ineficazes contra duas espécies alvo de fungos (Pyrenophora teres e Rynchosporium secalis). Nenhum dos rácios/taxas testados, incluindo taxas muito mais altas do que as recomendadas, controlaram efetivamente o crescimento dos fungos, sugerindo que este tipo de formulação provavelmente não é a mais vantajosa para o controlo destas pragas. No geral, os resultados indicam que um teste mais sistemático de formulações de pesticidas, como o que foi considerado nesta tese, nomeadamente no que diz respeito à avaliação de interações entre os ingredientes, segurança para organismos não-alvo, real eficácia contra espécies alvo, tendo ainda em vista a otimização das taxas de aplicação, poderá contribuir para aperfeiçoar (aumentar) a sua segurança ambiental e eficácia. Precedidos de uma revisão crítica sobre o potencial de C. elegans como um modelo relevante para ecotoxicologia, a neurotoxicidade e efeitos no desenvolvimento provocados pelo inseticida metomil foram efetivamente avaliados na segunda parte desta tese usando este modelo experimental numa abordagem multinível (comportamento e biometria, alterações bioquímicas e neurodegeneração); método computadorizado de “tracking” e uma estirpe transgénica fluorescente para o sistema colinérgico foram usados para avaliar os efeitos comportamentais e biométricos, e os danos neuronais, respetivamente. Os resultados salientaram que os efeitos do metomil no movimento e desenvolvimento de C. elegans foram transitórios e não resultaram em neurodegeneração dos neurónios colinérgicos. Após uma revisão abrangente de protocolos que podem ser usados para avaliar o comportamento de quimiotaxia em C. elegans, compararam-se ainda os efeitos de uma forma não-encapsulada vs. encapsulada do inseticida esfenvalerato neste modelo. O organismo foi bastante tolerante a exposições de curta duração ao esfenvalerato, para ambas as formas, no que diz respeito à ausência de efeitos significativos na letalidade e reprodução. Distintamente, o comportamento de quimiotaxia ao alimento foi aparentemente afetado pela menor concentração da forma não-encapsulada de esfenvalerato, tanto diretamente misturada com o alimento, como numa área próxima. Notavelmente, esta interferência na capacidade de localização do alimento pelo nematode não ocorreu quando o esfenvalerato foi apresentado na forma encapsulada. Dado que a resposta quimiosensorial é um comportamento chave, que afeta a sobrevivência de organismos multicelulares, estes resultados reforçam a importância deste parâmetro na avaliação ecotoxicológica de pesticidas. Para além do mais, a compatibilidade ambiental das formulações encapsuladas pode ser questionada com base nestes dados. Enquanto numa primeira perspetiva as formulações encapsuladas parecem exercer um efeito protetor ao prevenir efeitos no comportamento de quimiotaxia ao alimento, as cápsulas poderão funcionar como um “doce envenenado” no caso da sua incorporação pelos organismos. Isto reforça a necessidade de mais estudos de avaliação do potencial risco deste tipo de formulações para a biota do solo. Neste contexto, o “nobelizado” C. elegans, que permitiu notáveis avanços científicos na biologia do desenvolvimento e neurobiologia, poderá ser também muito valioso em estudos ambientais, nomeadamente na avaliação dos impactos de PFs.