Metabolomics screening of oxygen-glucose deprived neurons as a model of hypoxic-ischemic encephalopathy for newborns

Abstract

Hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is considered one of the most frequent causes of brain injury in newborns. This injury results from an event of asphyxia that can occur before, during, or after birth. HIE is a devastating episode that affects 1 to 8 infants per 1000 live births in developed countries, and this incidence is higher in underdeveloped countries. Cerebral palsy is one of the conditions most frequently associated with HIE. Currently, the diagnosis of HIE is based on clinical criteria that make it inaccurate, slow and inaccessible in several hospital units and countries. Regarding treatment, therapeutic hypothermia is considered the standard of care for newborns with HIE, but it has a small therapeutic window, within 6 hours after birth. Thus, it is essential and urgent to proceed to the discovery of biomarkers to help in the diagnosis of HIE. In this way, the aim of this study was to perform a metabolomics profiling of primary cultures of cerebrocortical neurons submitted to two models of neuronal death, a cellular model of HIE (oxygen and glucose deprivation (OGD)) and a glutamate-based model, to identify potential biomarkers that may be used in the clinical diagnosis of HIE. For this purpose, initially, primary cultures of neurons isolated from the cerebral cortex of Wistar rat embryos (E17-18) were prepared and at day in vitro 9, the cells were submitted to an OGD insult (2 hours) and a glutamate stimulus (20 minutes). After 24 hours (for the OGD insult) and after 6 hours (for the glutamate stimulus), the cellular proteome and metabolome were extracted, followed by precipitation of the proteins with methanol. Once the samples were prepared, a metabolomics analysis was performed by liquid chromatography coupled to tandem/hybrid mass spectrometry, in order to identify potential metabolites of interest. In this study, two analyses were performed: an untargeted metabolomics analysis and a targeted metabolomics analysis. After data processing and analysis, the metabolites tryptophan, β-NAD, FAD, and sphinganine were identified as potential biomarkers and sphingolipid metabolism as a possible altered metabolic pathway. These results may contribute to translational biomarker profiling for HIE. In the future, since the results were obtained from in vitro models, it is necessary to further validate them in the animal model of HIE and then in humans. The metabolomics analysis of the secretomes will allow to infer on circulating biomarkers.

A encefalopatia hipóxico-isquémica (HIE) é considerada uma das mais frequentes causas de lesão cerebral em recém-nascidos. Esta lesão resulta de um evento de asfixia que pode ocorrer antes, durante ou após o nascimento. A HIE é um episódio devastador que afeta 1 a 8 crianças por 1000 nascimentos em países desenvolvidos, sendo esta incidência maior em países subdesenvolvidos. A paralisia cerebral é uma das condições mais frequentemente associada a HIE. Atualmente, o diagnóstico de HIE é baseado em critérios clínicos que o tornam pouco preciso, lento e inacessível em várias unidades hospitalares e países. Em relação ao tratamento, a hipotermia terapêutica é considerada o padrão de tratamento para recém-nascidos com HIE, mas apresenta um janela terapêutica pequena, até 6 horas após o nascimento. Assim, é fundamental e urgente proceder à descoberta de biomarcadores para ajudar no diagnóstico de HIE. Deste modo, o objetivo deste estudo foi proceder à realização do perfil metabolómico de culturas primárias de neurónios cerebrocorticais submetidas a dois modelos de morte neuronal, um modelo celular de HIE (privação de oxigénio e glucose (OGD)) e um modelo baseado em glutamato, para identificar potenciais biomarcadores que possam vir a ser usados no diagnóstico clínico de HIE. Para tal, inicialmente, foram preparadas culturas primárias de neurónios isolados do córtex cerebral de embriões de ratos Wistar (E17-18) e ao dia in vitro 9, as células foram submetidas a um insulto de OGD (2 horas) e a um estímulo de glutamato (20 minutos). Após 24 horas (para o insulto de OGD) e após 6 horas (para o estímulo de glutamato), procedeu-se à extração do proteoma e do metaboloma celulares, seguida de precipitação das proteínas com metanol. Uma vez preparadas as amostras, foi realizada uma análise metabolómica por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa tandem/híbrida, de modo a identificar potenciais metabolitos de interesse. Neste estudo foram realizadas duas análises: uma análise metabolómica não direcionada e uma análise metabolómica direcionada. Após processamento e análise dos dados, os metabolitos triptofano, β-NAD, FAD, e esfinganina foram identificados como sendo potenciais biomarcadores e o metabolismo dos esfingolípidos como sendo uma via metabólica possivelmente alterada. Estes resultados podem contribuir para a realização de um perfil de biomarcadores translacionais para HIE. No futuro, uma vez que os resultados foram obtidos de modelos in vitro, é necessário proceder à sua posterior validação no modelo animal de HIE e, de seguida, em humanos. A análise metabolómica dos secretomas permitirá inferir sobre biomarcadores circulantes.