Cell-specific targeted nanosystem to modulate the tumour microenvironment

Abstract

Cancer treatments remain strongly reliant on conventional therapies that have limited efficacy as well as cytotoxic side-effects on off-target healthy cells. Immunotherapy presents a promising approach for training the host’s immune system to fight the tumour. However, currently approved immunotherapeutic treatments are hampered particularly by low response rates and autoimmune responses, despite their potential in case of full response. Further investigating and improving the actuation of this therapeutic approach would contribute to future oncologic treatment options. The tumour microenvironment plays a pivotal role in carcinogenesis, dynamically changing to provide the tumour with the appropriate conditions for progression. Macrophages in the tumour microenvironment pose as a particularly promising target for immunotherapy, as their tumour-induced immunosuppressive behaviour can be reprogrammed towards tumour-hostile activity through their repolarization into M1 macrophages. Targeting macrophages for cancer therapy to activate the immune system is possible through the use of a nanocarrier to target the desired cells and deliver the therapeutic agent, such as nucleic acids. In this work, the main goal was to develop a novel lipid nanocarrier for the targeted delivery of mRNA to activated macrophages. For this, cationic liposomes, containing in their formulation a targeting lipid to provide the cell-specific delivery to macrophages, were synthetized, loaded with eGFP- or luciferase-encoding mRNA and characterized for their size, polydispersity index, zeta potential and encapsulation efficiency through Dynamic Light Scattering and spectrophotometry. Their effects on the macrophage RAW 264.7 cell line were examined through fluorescent microscopy, flow cytometry, luminescence detection, and their metabolic activity was assessed with an Alamar Blue assay. These steps were followed also for a formulation of liposomes without the TL to test the targeting ability of the nanoparticles. The obtained liposomes possessed a size of approximately 130 nm for the unloaded nanoparticles, with an increase in size with loading for micrometre-range dimensions. Their zeta potential ranged from 52 – 57 mV in the unloaded particles, varying then with their loading with RNA. The lipoplexes successfully transfected RAW 264.7 macrophages and induced the production of the intended proteins. Nevertheless, their targeting ability towards macrophages, compared to tumour cells, still requires further investigation.

Os tratamentos oncológicos permanecem fortemente dependentes das terapias convencionais, com eficácia limitada e efeitos secundários nefastos nas células saudáveis. A imunoterapia mostra-se como uma abordagem promissora para treinar o sistema imunitário do hóspede para combater o tumor. No entanto, as imunoterapias atualmente aprovadas possuem uma baixa taxa de resposta e podem desencadear respostas autoimunes, apesar do seu potencial em casos de resposta bem-sucedida. Assim, novos avanços e melhorias na atuação desta forma terapêutica contribuiriam para futuras opções de tratamento oncológico. O microambiente tumoral desempenha um papel primordial na carcinogénese e, evoluindo dinamicamente, proporciona ao tumor condições apropriadas para a sua progressão. Os macrófagos que dele fazem parte são um alvo particularmente promissor em imunoterapia, visto que o seu comportamento imunossupressor induzido pelo tumor pode ser revertido através da sua repolarização para macrófagos M1. O targeting de macrófagos para terapia oncológica visando ativar o sistema imunitário é possível recorrendo a veículos nanométricos para entregar o agente terapêutico, como é o caso dos ácidos nucleicos. O principal objetivo do presente trabalho focou-se no desenvolvimento de nanopartículas capazes de entregar seletivamente mRNA a macrófagos ativados. Para isto foram sintetizados lipossomas catiónicos, cuja formulação contém um lípido de entrega seletiva para macrófagos, carregados com mRNA codificante para eGFP ou luciferase, e caracterizados quanto ao seu tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta e eficiência de encapsulamento através de técnicas de difusão dinâmica da luz e espectrofotometria. O seu efeito na linha celular de macrófagos RAW 264.7 foi avaliado através de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo, deteção de luminescência, e atividade metabólica avaliada num ensaio com Alamar Blue. Estes passos foram repetidos para uma formulação de lipossomas sem o lípido para entrega específica, visando testar essa mesma propriedade. Os lipossomas obtidos possuem um tamanho de aproximadamente 130 nm nos lipossomas vazios, que aumentou aquando do seu carregamento para dimensões micrométricas. O seu potencial zeta variou dos 52 aos 57 mV nas partículas vazias, alterando-se após o seu carregamento. Os lipossomas transfetaram com sucesso os macrófagos RAW 264.7 e induziram a produção das proteínas pretendidas. No entanto, a sua capacidade de entrega específica para os macrófagos, face a células tumorais, necessitará ainda de ser mais escrutinada.