Synthesis and cytotoxicity studies of pyrazoles to counteract DNA damage and neurodegeneration induced by oxidative stress

Abstract

Currently, neurodegenerative diseases are the most prevalent and worrying in the elderly population, being an important focus of study in the scientific community. This set of diseases is vast and includes, for example, Alzheimer's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis. Given that the average life expectancy is increasing, more concerns about age-related diseases arise. The latter are generally characterized by a progressive and irreversible neuronal degeneration, which culminates in the destruction and death of certain populations of neurons resulting in functional complications such as loss of memory and other cognitive functions, motor dysfunction, language difficulties and respiratory problems, which lead to death. There are several theories to explain the origin of these diseases. One of the most important ones suggests that neurodegeneration is caused by the existence of an oxidizing environment, caused by oxidative stress, which is harmful to living tissues. The oxidative stress is defined as an imbalance between the amount of oxidant and antioxidant species in the body. These oxidizing species are harmful because they interact with proteins and lipids, resulting in tissue damage, namely in the nervous system, a particularly vulnerable tissue, and with nucleic acids leading to DNA damage. To counteract oxidative stress, body produces antioxidants and to counteract DNA damage, DNA damage repair pathways are activated. The most important repair pathways, in particular for single-strand chain damage repairing (SSB), the most common damage induced by reactive oxygen species (ROS), is the BER and the PARP pathways. When the error is not repaired, it might culminate in cell death and degeneration. Targets of increasing attention in scientific research, pyrazoles are synthetic compounds that have several biological activities, including anti-inflammatory, antioxidant and neuroprotective. This work intends, firstly, to present an analysis of the mechanisms by which oxidative stress interacts with living tissues, namely in the neurodegeneration process and the occurrence of DNA damage, as well as the mechanisms by which DNA damage itself is also capable to cause neurodegeneration. Next, the molecular mechanisms for reversing these damages are presented and studies showing the action of compounds similar to those studied in this work in reversing oxidative stress, acting as antioxidants, and DNA damage by acting as activators of repair pathways. In summary, the theoretical possibility of pyrazoles being effective in reversing neurodegeneration and DNA damage caused by oxidative stress in living organisms will be studied in this work. Thus, initially styrylpyrazole-type compounds were synthesized and characterized by nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrometry in order to confirm their structure and purity. Subsequently, in vitro studies were carried out to assess the cytotoxicity of the synthesized compounds, in human cells, using the resazurin method and these studies were further complemented by Western-Blot studies to assess DNA damage. The results obtained allowed establishing some preliminary structure-activity studies that are important for the design of new compounds of this type and indicated that, in general, the studied compounds are not cytotoxic or only present significant cytotoxicity at higher concentrations, thus being promising for the follow-up of the studies initiated in this work.

Atualmente, as doenças neurodegenerativas são as mais prevalentes e preocupantes na população idosa, sendo um importante foco de estudo da comunidade científica. Este conjunto de doenças é vasto e inclui, por exemplo, a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson e a esclerose lateral amiotrófica. Dado que a esperança média de vida está a aumentar, surgem mais preocupações com as doenças relacionadas com a idade. Estas são genericamente caracterizadas por uma degeneração neuronal progressiva e irreversível, que culmina com a destruição e morte de certas populações de neurónios, surgindo complicações funcionais, como perda de memória e de outras funções cognitivas, disfunções motoras, dificuldades de linguagem e problemas respiratórios, que levam à morte. Existem várias teorias para explicar a origem dessas doenças. Uma das mais importantes sugere que a neurodegeneração é causada pela existência de um ambiente oxidante, resultante de stress oxidativo, que é prejudicial a todos os tecidos do nosso organismo. Este define-se como um desequilíbrio entre a quantidade de espécies oxidantes e antioxidantes no organismo. Essas espécies oxidantes são prejudiciais por interagirem com proteínas e lípidos, resultando em danos nos tecidos, nomeadamente do sistema nervoso, um tecido particularmente sensível à neurodegeneração, e com os ácidos nucleicos podendo resultar em danos no ADN. Para reverter o stress oxidativo, o organismo produz antioxidantes, e para reverter o dano no ADN, vias de reparo do dano no ADN são ativadas. As vias de reparo mais importantes, em particular para o reparo de danos do tipo SSB, o dano mais comum induzido por ROS, são as vias BER e PARP. Quando o erro não é reparado, pode culminar em morte e degeneração celular. Alvos de crescente atenção em investigação científica, os pirazóis são compostos sintéticos que possuem diversas atividades biológicas, nomeadamente anti-inflamatória, antioxidante e neuroprotetora. Este trabalho pretende, em primeiro lugar, apresentar uma análise dos mecanismos pelos quais o stress oxidativo interage com os tecidos vivos, nomeadamente no processo de neurodegeneração e no surgimento de dano do ADN bem como os mecanismos pelos quais o próprio dano do ADN é também capaz de conduzir à neurodegeneração. De seguida, apresentam-se os mecanismos moleculares de reversão desses danos e estudos que mostram a ação de compostos semelhantes aos estudados neste trabalho na reversão do stress oxidativo, atuando como antioxidantes e do dano de ADN atuando como potencializadores das vias de reparo. Em resumo, será estudada neste trabalho a possibilidade teórica de pirazóis serem eficazes na reversão da neurodegeneração e dos danos de ADN causados pelo stress oxidativo em organismos vivos. Assim, inicialmente foram sintetizados compostos do tipo estirilpirazóis e caracterizados por espetroscopia de ressonância magnética nuclear e espetrometria de massa de modo a confirmar a sua estrutura e pureza. Posteriormente, procedeu-se a estudos in vitro para avaliar a citotoxicidade dos compostos sintetizados, em células humanas, usando o método da resazurina e estes estudos foram ainda complementados por estudos de Western-Blot para avaliar o dano no ADN. Os resultados obtidos permitiram estabelecer alguns estudos de estrutura-atividade preliminares que são importantes para o desenho de novos compostos deste tipo e indicaram que, em geral, os compostos estudados não são citotóxicos ou apenas apresentam citotoxicidade significativa em concentrações mais elevadas, sendo assim promissores para o seguimento dos estudos iniciados neste trabalho.