Investigation of non-AUG dependent pentanucleotide repeat translation in SCA37

Abstract

Spinocerebellar ataxias (SCAs) are a heterogeneous group of neurodegenerative diseases, usually with late onset, for which there is no cure. SCAs are mainly characterized by progressive cerebellar degeneration leading to symptoms of gait imbalance, limb incoordination and dysarthria, often associated with dementia, epilepsy and migraine. SCA37 is an autosomal dominant inherited disease caused by an (ATTTC)n insertion in a 5’-UTR intron of DAB1 gene. SCA37 is a disease with hundreds of affected and at-risk individuals in Portugal and Spain. Unaffected individuals have two (ATTTT)n alleles ranging from 7-400 repeat units, while affected individuals carry one allele with the configuration [(ATTTT)60–79(ATTTC)31–75(ATTTT)58–90]. The (AUUUC)n RNA forms nuclear aggregates in transfected human cell lines and is toxic when injected in zebrafish embryos, indicating that this repetitive RNA mediates a cascade of pathogenic mechanisms not yet fully understood. Many diseases caused by pathogenic transcribed repeats are characterized by non-canonical translation of the repeat expansion, by a mechanism known as repeat associated non-AUG dependent (RAN) translation. RAN translation leads to the production of repetitive polypeptides from the three reading frames of the repeat expansion, which are often toxic being implicated in the neurodegenerative phenotype. Therefore, in this work, I aimed to investigate if the (ATTTC)n insertion causing SCA37 is abnormally translated by RAN. To achieve this aim, I engineered different constructs to detect RAN translation from the three (ATTTC)n reading frames, all encoding poly(ISFHF). I cloned the SCA37 pathogenic and nonpathogenic alleles in mammalian expression vectors, then I placed 2 stop codons in each frame upstream the repeat and 3 epitopes (HA, myc and flag), one in each reading frame, downstream the repeat. I confirmed in silico that the developed constructs were able to lead to the translation of the putative RAN pentapeptide fused with a tag epitope. Then, I transfected HEK293T and human neural stem cells (hNSC) with these constructs and I showed that the (AUUUC)n RNA was being transcribed, by fluorescence in situ hybridization. After this, I analysed the production of poly(ISFHF) 72h post-transfection, by dot blot and western blot using α-HA, α-myc, α-flag and α-poly(ISFHF) antibodies. Despite having used different human cell lines and genetic backbones, I did not detect SCA37 RAN pentapeptides translated in vitro from any frame of the (ATTTC)n insertion. Since SCA37 is a late-onset disease, poly(ISFHF) may require decades of accumulation in cerebellar neurons to become detectable, which is not mimicked in transfection assays in proliferative cell lines.

As ataxias espinocerebelosas (SCAs) são um grupo de doenças neurodegenerativas geralmente com início tardio, para as quais não há cura. As SCAs caracterizam-se por degeneração cerebelar progressiva que leva ao desequilíbrio da marcha, perda de coordenação dos membros e disartria, sintomas geralmente associados a demência, epilepsia e enxaqueca. A SCA37 é uma doença hereditária autossómica dominante causada por uma inserção de (ATTTC)n num intrão localizado na 5’-UTR do gene DAB1. Em Portugal e Espanha, há centenas de indivíduos afetados ou em risco de ter SCA37. Indivíduos não afetados têm dois alelos com 7-400 repetições de ATTTT, enquanto indivíduos afetados têm um alelo com a configuração [(ATTTT)60–79(ATTTC)31–75(ATTTT)58–90]. O RNA (AUUUC)n forma agregados nucleares em linhas celulares humanas transfetadas e é tóxico quando injetado em embriões de zebrafish, o que indica que este RNA repetitivo inicia uma cascata de mecanismos patogénicos que ainda não são totalmente compreendidos. Muitas doenças causadas por transcritos repetitivos caracterizam-se pela tradução não canónica da expansão repetitiva, por um mecanismo chamado tradução associada a repetições independente de AUG (RAN). A tradução RAN leva à produção de polipéptidos repetitivos a partir das três fases de leitura da expansão repetitiva, e estes polipéptidos geralmente são tóxicos e contribuem para o fenótipo neurodegenerativo. Como tal, neste trabalho, o meu objetivo foi investigar se a inserção repetitiva (ATTTC)n que causa a SCA37 é aberrantemente traduzida por RAN. Para tal, gerei diferentes construtos para deteção da tradução RAN a partir das três fases de leitura do (ATTTC)n, sendo que todas elas codificavam poli(ISFHF). Primeiro, clonei o alelo patogénico da SCA37 e alelos não patogénicos em vetores de expressão de mamíferos, depois inseri 2 codões de terminação em cada fase de leitura a montante da sequência repetitiva e 3 epitopos (HA, myc e flag), um em cada fase de leitura, a jusante da sequência repetitiva. Confirmei in silico que os vetores desenvolvidos eram capazes de levar à tradução do pentapéptido RAN putativo fundido com um epitopo. Transfetei células estaminais neurais humanas (hNSC) e HEK293T com estes vetores e confirmei que o RNA (AUUUC)n era transcrito, por hibridização fluorescente in situ. Por fim, analisei a produção de poli(ISFHF) 72h pós-transfeção, por dot blot e western blot com anticorpos α-HA, α-myc, α-flag, e α-poli(ISFHF). Apesar de ter usado diferentes linhas celulares humanas e vetores, não detetei péptidos RAN traduzidos in vitro a partir de nenhuma das fases de leitura da inserção (ATTTC)n. Uma vez que a SCA37 é uma doença de manifestação tardia, talvez sejam necessárias décadas de acumulação em neurónios cerebelares para o poli(ISFHF) se tornar detetável, o que não é possível mimetizar com ensaios de transfeção em linhas celulares proliferativas.