Chlorella vulgaris and Porphyridium purpureum: two microalgae with polysaccharides and other potential valuable compounds

Abstract

Chlorella vulgaris and Porphyridium purpureum are two eukaryotic microalgae that have been highlighted from the biotechnological point of view due to their capability of producing multiple interesting metabolites, such as pigments and polysaccharides, beyond protein and lipids. Chlorella vulgaris is green due to the high cholorophyll content, representing a valuable source of this food aditive. However, since chlorophylls are sensitive compounds, they degrade easily by various mechanisms during storage. Aiming to find food grade suitable conditions for isolated chlorophylls preservation, C. vulgaris chlorophylls were extracted with 96% ethanol to study the influence of temperature, light, alkaline conditions, and modified atmosphere on the stability of the color in ethanolic solutions. Under the conditions used, the color loss was mainly due to the intense light (photoperiod 24 h), followed by the hight temperature (60 °C). The loss of green color in the ethanolic solution with temperature followed the first-order kinetic, being more significant between 28 and 60 °C, with an activation energy of 74 kJ/mol. To lower temperatures C. vulgaris chlorophylls showed resistance to the degradation when preserved in ethanol solutions. The addition of NaOH and the inert argon-rich atmosphere did not exhibit a statistically positive effect on the color preservation. Thus, C. vulgaris ethanolic extract showed to be more stable when protected from light at room temperature or bellow. C. vulgaris ethanolic extract showed to be a suitable natural food additive to coloring food stuffs. As case of study, the cooked cold rice was colored to be used in sushi. The color remained stable up to 3 days of storage at 4 ºC, either in the presence or absence of light. Beyond the high content in chlorophylls, C. vulgaris is rich in starch and structural polysaccharides that could have also great potential to be valued as food ingredients. Therefore, to fulfill this hypothesis, starch digestibility was evaluated in raw and boiled biomass, showing 43% and 71% of glucose released, respectively. The low extraction yield of starch obtained with water (13%) allowed to infer protein hindrance. This was overcome by 1 M and 4 M KOH aqueous solutions that allowed to obtain an additional 51% of starch. The final residue left showed that only 16% of total starch remained unextracted. KOH solutions allowed also to obtain galactans composed by 1,3-, 1,6- and 1,3,6-linked galactose residues. These linkages were also observed in the polysaccharides recovered from the growth medium, showing similarity between the exopolysaccharides and those present in the cell wall. The extracellular polymeric material revealed in vitro immunostimulatory effect on B lymphocytes. Porphyridium purpureum, also recognized as Porphyridium cruentum, is a red saline microalga that have been aroused commercial interest to be used for feeding fish in aquaculture. This microalga is rich in proteins and floridean starch, having the ability to excrete high levels of sulfated polysaccharides (sEPS) into the growth medium. P. purpureum is easily cultivated and could change their growth rate and composition in response to environmental variations. Thus, the impact of growth medium salinity (18, 32, and 50 g/L NaCl) on P. purpureum cells growth, biomass composition and on the extracellular polysaccharides production yield and chemical structure were evaluated. A maximum growth estimated as 5.7×106 cells/mL was obtained for 32 g/L of NaCl, after 19 days of growth. Besides biomass composition was not greatly changed, the sEPS excretion yield reflected the effect of salinity, higher for 32 g/L of NaCl (90 mg/L). The growth medium salinity slightly changed the sulfation pattern of the glucuronoglucogalactoxylan, since sEPS produced from P. purpureum grown at lower salinity tend to be more sulfated in O-3 position of xylose and O-6 position of glucose, while at higher salinity the sEPS tend to be more sulfated in O-4 position of xylose and glucose. The sEPS produced at higher salinity also revealed higher content of linear 2-Gal, 3-Gal, and 4-Gal residues. In all samples, the most representative sugar residues were constituted by t-Xyl, t-Xyl4S, 3-Xyl, 4-Xyl, t-Glc, 3-Glc6S, t-Gal, and 2,3,4-Gal. The sEPS showed immunostimulatory effect on B lymphocytes in vitro, similarly to the effect also demonstrated by the C. vulgaris extracellular polysaccharides. P. purpureum sEPS could be produced at large scale at an outdoor 800 L-flat panel photobioreactor with higher excretion yield (144 mg/L), revealing the potential of industrial production and commercialization of sEPS. In conclusion, this PhD thesis significantly upgraded the knowledge about the biotechnological potential of C. vulgaris pigments and both starch and exopolysaccharides, as food ingredients, with the additional commercial advantage of the possibility of these metabolites’ co-extraction. Moreover, P. purpureum sEPS revealed biotechnological potential to be used in aquaculture to enhance humoral immunoactivity of fish.

As microalgas eucarióticas Chlorella vulgaris e Porphyridium purpureum têm-se destacado do ponto de vista biotecnológico devido à capacidade de produzirem vários metabolitos com interesse comercial, como pigmentos e polissacarídeos, para além da proteína e dos lípidos. A Chlorella vulgaris é verde devido ao seu alto teor em clorofila, sendo uma fonte valiosa deste aditivo alimentar. No entanto, uma vez que as clorofilas são compostos bastante sensíveis, podem degradar-se facilmente por vários mecanismos quando armazenadas. Assim, com o objetivo de determinar as condições mais apropriadas para a preservação de clorofilas isoladas, as clorofilas da C. vulgaris foram extraídas com 96% de etanol para estudar a influência da temperatura, luz, alcalinidade e atmosfera modificada na estabilidade da cor nas soluções etanólicas. Nas condições avaliadas, a perda da cor verde deveu-se principalmente à ação da luz (com um fotoperíodo de 24 h), seguida da temperatura elevada (60 °C). A perda da cor verde das soluções etanólicas com o aumento da temperatura seguiu uma cinética de 1.ª ordem, sendo mais significativa entre os 28 e os 60 °C, apresentando uma energia de ativação de 74 kJ/mol. Para temperaturas mais baixas observou-se uma resistência das clorofilas à degradação quando preservadas em etanol. A adição de NaOH e a atmosfera inerte rica em árgon não apresentaram um efeito estatisticamente positivo na preservação da cor verde. Desta forma, o extrato etanólico de C. vulgaris foi mais estável quando preservado no escuro à temperatura ambiente ou a temperaturas mais baixas. Os extratos etanólicos da C. vulgaris mostraram ser um aditivo alimentar natural adequado para corar produtos alimentares de verde. Como caso de estudo, foi corado arroz cozido frio para ser usado em sushi. Esta cor manteve-se estável durante pelo menos 3 dias de armazenamento, tanto na presença como na ausência de luz. Para além do alto teor em clorofilas, a microalga C. vulgaris é rica em amido e polissacarídeos estruturais, que podem também ter elevado potencial de valorização enquanto ingredientes alimentares. Assim, de forma a testar esta hipótese, a digestibilidade do amido foi avaliada na biomassa crua e cozida de C. vulgaris, apresentando uma libertação de 43 e 71% de glucose, respetivamente. A baixa extratabilidade do amido obtido com água quente mostrou um impedimento devido à presença de proteína. Este impedimento de extração foi ultrapassado usando soluções aquosas de 1 M e de 4 M de KOH, permitindo obter mais 51% do total de amido da microalga. O resíduo final obtido após as extrações mostrou que apenas 16% do amido ficou por extrair. Para além disso, as soluções de KOH também permitiram obter galactanas contendo resíduos de galactose com ligações nos carbonos 1,3, 1,6 e 1,3,6. Estas ligações também foram observadas nos polissacarídeos recuperados do meio de cultura, mostrando uma similaridade entre os polissacarídeos extracelulares e os polissacarídeos presentes na parede celular. O material polimérico extracelular revelou um efeito imunoestimulador in vitro em linfócitos B. A microalga vermelha salina Porphyridium purpureum, também conhecida por Porphyridium cruentum, tem despertado interesse comercial para ser usada para alimentação de peixes em aquacultura. Esta microalga é rica em proteínas, amido florídeo e tem a capacidade de excretar elevados níveis de polissacarídeos sulfatados (sEPS) para o meio de cultura. A microalga P. purpureum é cultivada facilmente e pode alterar a sua taxa de crescimento e a sua composição em resposta a alterações ambientais. Neste contexto, foi avaliado o impacto da salinidade do meio de cultura (18, 32 e 50 g/L de NaCl) no crescimento celular da P. purpureum, assim como na composição da sua biomassa e no rendimento de produção e estrutura química dos seus polissacarídeos extracelulares. Um crescimento máximo estimado de 5.7×106 células/mL foi obtido no meio de cultura com uma salinidade de 32 g/L de NaCl, após 19 dias de crescimento. Apesar da composição da biomassa da microalga P. purpureum não mudar significativamente com o nível de salinidade do meio de cultura, o rendimento de excreção dos sEPS foi maior para a cultura com 32 g/L de NaCl (90 mg/L). Para além disso, a salinidade do meio de cultura também alterou ligeiramente o padrão de sulfatação das glucuronoglucogalactoxilanas, uma vez que os sEPS produzidos pela P. purpureum que cresceu com o menor nível de salinidade, tendem a ser mais sulfatados na posição O-3 da xilose e na posição O-6 da glucose, enquanto a salinidades superiores os sEPS tendem a ser mais sulfatados na posição O-4 da xilose e da glucose. Os sEPS produzidos com salinidades maiores também revelaram uma maior percentagem de resíduos lineares de 2-Gal, 3-Gal e 4-Gal. No entanto, em todas as amostras, os resíduos de açúcares mais representativos foram os t- Xyl, t-Xyl4S, 3-Xyl, 4-Xyl, t-Glc, 3-Glc6S, t-Gal e 2,3,4-Gal. Os sEPS mostraram um efeito imunoestimulador in vitro nos linfócitos B, à semelhança do efeito também demonstrado pelos polissacarídeos extracelulares da C. vulgaris. A produção destes sEPS pela microalga P. purpureum pode ser realizada a larga escala num fotobiorreator de placas planas verticais de 800 L com um bom rendimento de excreção (144 mg/L), comprovando a viabilidade destes sEPS para produção industrial e comercialização. Em conclusão, esta tese de doutoramento aumentou o conhecimento do potencial biotecnológico dos pigmentos e polissacarídeos da C. vulgaris como ingredientes alimentares, com a vantagem comercial adicional de poderem ser co-extraídos. Além disso, os polissacarídeos extracelulares sulfatados da microalga P. purpureum revelaram um grande potencial para serem usados na aquacultura, de forma a aumentar a atividade imunoestimuladora dos peixes.