Validation of candidate genes for resistance to powdery mildew in grass pea (Lathyrus sativus)

Abstract

Lathyrus sativus (grass pea) is a promising grain legume crop for a more sustainable agriculture, combining dietary advantages with exceptional agronomic properties. Among them, L. sativus is an extremely resilient crop to both abiotic and biotic stress, which gives it a great potential to be used in disease resistance studies. Erysiphe pisi is the causal agent of pea (Pisum sativum) powdery mildew, and it has the capability to infect other Leguminosae, such as L. sativus. This disease can be quite severe and infected crops can experience severe yield losses. Although the impact of powdery mildew disease is great and the resistance mechanisms of L. sativus are still not well known, promising resistance mechanisms have already been identified. Candidate resistance genes against E. pisi were recently identified in Lathyrus spp. However, the gene expression analysis and functional validation of those genes in order to verify the genes’ functional reaction in infected plants, is still missing. In this study, 13 candidate resistance genes were selected from studies on Leguminosae–fungi molecular interactions. The main objective was to evaluate the expression dynamics of candidate resistance genes quantified in two partial resistant and two susceptible grass pea accessions, non-inoculated and inoculated, at five time points after infection with E. pisi, by Real-Time quantitative PCR (RT-qPCR). From the starting 13 selected genes, expression patterns of eight candidate resistance genes was analyzed, from which, AT-Hook motif nuclear-localized protein (AT-Hook), the mitochondrial ATP synthase subunit 9 (ATP), L. sativus Mildew Locus O 1 (LsMLO1) and pea disease resistance response protein (Pi49) genes showed the most potential for further functional validation based on the high levels of fold change in partial resistant genotypes compared to the most susceptible non inoculated (0h) genotype. Also, on their previously known biological functions in plant-pathogen interactions, such as ATP synthase, disease response proteins and gene expression regulator proteins. This study provides clues about the putative resistance molecular mechanisms underlying the L. sativus response against E. pisi, which should be useful in gene selection for future development of molecular tools able to assist in breeding L. sativus, and phylogenetically similar species against E. pisi.

O Lathyrus sativus (chícharo) é uma leguminosa promissora para uma agricultura mais sustentável, combinando vantagens dietéticas com propriedades agronómicas excecionais. É uma cultura extremamente resistente ao stress abiótico e biótico, o que lhe confere um grande potencial para ser utilizado em estudos de resistência a doenças. Erysiphe pisi é o agente causal do oídio da ervilha (Pisum sativum) e tem a capacidade de infetar outras leguminosas, como o L. sativus. Esta doença pode ser bastante grave e colheitas infetadas podem sofrer grandes perdas de rendimento. Apesar do grande impacto da doença, e os mecanismos de resistência do L. sativus ainda não serem bem conhecidos, algumas fontes de resistência já foram identificadas neste. Genes candidatos de resistência contra E. pisi foram recentemente identificados em Lathyrus spp., no entanto, a análise da expressão génica e validação funcional desses genes ainda precisa de ser realizada para avaliar a resistência realmente conferida contra E. pisi. Neste estudo, 13 genes candidatos de resistência foram selecionados a partir da bibliografia existente sobre as interações moleculares Leguminosae-fungos. O objetivo principal foi avaliar a dinâmica de expressão de genes candidatos de resistência quantificados em dois genótipos de chícharo parcialmente resistentes e dois suscetíveis, não inoculados e em cinco momentos após infeção por E. pisi, por PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR). Dos 13 genes selecionados, foi feita a análise de expressão de oito genes de resistência candidatos, dos quais, a proteína com um AT-Hook motif localizada no núcleo (AT-Hook), a subunidade 9 da ATP sintase mitocondrial (ATP), o L. sativus Mildew Locus O1 (LsMLO1) e a proteína de resposta de resistência a doenças em ervilha (Pi49) mostraram o maior potencial para validação funcional adicional, com base nos altos níveis de variação de expressão génica em genótipos com resistência parcial em comparação com o genótipo mais suscetível não inoculado (0h). Os genes foram também escolhidos pelas suas funções biológicas previamente conhecidas em interações planta-patógeno, como ATP sintase, proteínas de resposta a doenças e proteínas reguladoras de expressão génica. Este estudo fornece novas pistas sobre os mecanismos moleculares de resistência putativos subjacentes à resposta de L. sativus contra E. pisi, que poderão ser úteis na seleção de genes para o desenvolvimento futuro de ferramentas moleculares capazes de auxiliar o melhoramento de L. sativus e espécies filogeneticamente semelhantes contra E. pisi.