Searching for mitochondrial targets of the ubiquitin ligase APC/CCdh1

Abstract

The Anaphase promoting Complex/Cyclosome (APC/C) is an E3 ubiquitin ligase involved in cell cycle progression by targeting cell-cycle regulators for degradation. It is conserved from yeast to humans and relies on two adaptor proteins, Cdc20 and Cdh1, which identify its substrates due to the presence of recognition motifs. In humans, Cdh1 recognizes a broader set of substrates than Cdc20, including Drp1, a protein involved in mitochondrial fission. Unpublished studies from our group revealed that Atp2, an ATPsynthase subunit, is also increased in the absence of Cdh1 suggesting that APC/CCdh1 may play a broader role in mitochondrial function than expected. As such, the objectives of this work were to investigate the role of APC/CCdh1 in mitochondrial function using a proteomic approach, and identify the players involved. We used high-resolution mass spectrometry to obtain a global view of the impact of Cdh1 on the yeast mitochondrial proteome. With a coverage of ~97%, we found 12% of proteins have a significantly increased abundance in the absence of CDH1. These included subunits from all the respiratory complexes, enzymes from the Krebs cycle and regulators of mitochondria morphology (including Dnm1/Drp1). These protein classes are known to be essential for the adaptation of mitochondria to respiratory metabolism. We also found that 19% of the proteins were downregulated, being associated to non-respiratory processes. Interestingly, nearly all the cdh1Δ-altered proteins have the signature of 4 transcription factors (TFs), Rpn4, Pdr3, Yap1, and Gcn4, suggesting Cdh1 may be regulating mitochondrial proteins by targeting TFs. Supporting this hypothesis, the higher Atp2 levels and mitochondrial respiration in cdh1Δ strain decreased upon RPN4 and YAP1 deletion indicating these stress response TFs act downstream of Cdh1. In agreement, Yap1 is transcriptionally more active in the absence of Cdh1 and its absence decreases the slow growth of cdh1Δ cells. In addition, Yap1 protein levels are strongly decreased in the G1 phase of the cell cycle, in which APC/CCdh1 activity peaks, suggesting Cdh1 targets Yap1 for degradation. Overall, these results indicate a novel role for Cdh1 in the regulation of mitochondrial metabolic remodeling through Yap1 regulation. Regulation of Yap1 during cell cycle may allow coupling the known transient increase in mitochondrial respiration, important to meet cell cycle energetic demands, with the expression of antioxidant defenses, vital to mitigate the reactive oxygen species byproducts of respiration.

O Complexo promotor de anáfase/ciclossoma (APC/C) é uma ubiquitina ligase E3 envolvida na progressão do ciclo celular, com um papel na degradação dos reguladores do ciclo celular. É conservado em vários organismos, incluindo a levedura e mamíferos, e depende de duas proteínas adaptadoras, Cdc20 e Cdh1, que identificam os seus substratos, devido à presença de motivos de reconhecimento. Em humanos, a Cdh1 reconhece um conjunto mais abrangente de substratos do que a Cdc20, incluindo Drp1, uma proteína envolvida na fissão mitocondrial. Estudos do nosso grupo revelaram que os níveis de uma outra proteína mitocondrial, Atp2, uma subunidade da ATPsintase, aumentam na ausência de Cdh1 (trabalho não publicado). Esses dados sugerem que APC/CCdh1 pode desempenhar um papel mais abrangente do que o esperado na regulação das proteínas mitocondriais. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram investigar o papel da APC/CCdh1 no controlo da função mitocondrial através de uma análise de proteómica e identificar os fatores envolvidos nesta regulação. Utilizamos espectrometria de massa de alta resolução para avaliar o impacto da Cdh1 no proteoma mitocondrial de levedura. Com uma cobertura de ~97%, identificamos 12% de proteínas com uma abundância significativamente aumentada na ausência de CDH1. Estas incluíram subunidades de todos os complexos respiratórios, enzimas do ciclo de Krebs e reguladores da morfologia mitocondrial (incluindo Dnm1/Drp1). Estas classes de proteínas são essenciais para a adaptação das mitocôndrias ao metabolismo respiratório. Também identificamos 19% de proteínas cuja abundância era significativamente reduzida, associadas a processos não respiratórios. Curiosamente, quase todas as proteínas alteradas no mutante cdh1Δ possuem sítios de ligação de 4 fatores de transcrição (TF), Rpn4, Pdr3, Yap1 e Gcn4, sugerindo que Cdh1p pode regular proteínas mitocondriais, através da regulação de TFs. Concordante com esta hipótese, os níveis mais elevados de Atp2 e a elevada respiração mitocondrial na estirpe cdh1Δ, diminuíram após a deleção de RPN4 e YAP1, indicando que estes TFs de resposta ao stresse atuam a jusante de Cdh1. Adicionalmente, o TF Yap1 é transcripcionalmente mais ativo nas células deficientes em Cdh1 e a sua ausência reduz o crescimento lento da estirpe cdh1Δ. Além disso, os níveis proteicos de Yap1 encontramse significativamente reduzidos na fase G1 do ciclo celular, fase na qual a atividade de APC/CCdh1 é máxima, sugerindo que Cdh1 regula a degradação do Yap1. Em conclusão, estes resultados revelam uma nova função para o Cdh1 na regulação metabólica da mitocôndria, através da regulação do TF Yap1. A regulação do Yap1 durante o ciclo celular pode permitir acoplar o aumento da respiração mitocondrial, importante para assegurar a energia necessária para o ciclo celular, com a expressão das defesas antioxidantes, essenciais para eliminar as espécies reativas de oxigénio, subprodutos da respiração.