A multi-biomarker assessment of single and combined effects of oxytetracycline and ciprofloxacin on Mytilus spp

Abstract

Antibiotics are a class of drugs widely used throughout the world to treat infections in both humans and animals. Due to their widespread use, these drugs are eventually released into the environment, as wastewater treatment plants are not efficient in eliminating them. This causes these compounds to be widely distributed in aquatic environments, justifying concerns about the impact they may have on the species present there. Thus, this work aims to characterize the toxicity arising from acute (96h) and chronic (28 days) exposure to two antibiotics, oxytetracycline (0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5 and 5 μgL-1) and ciprofloxacin (0, 0.005, 0.013, 0.031, 0.078 and 0.195 mgL-1) and their mixture (0, 0.005 mgL-1 CIP + 0. 3125 μgL-1 OTC, 0.031 mgL-1 CIP + 1.25 μgL-1 OTC, and 0.195 mgL-1 + 5 μgL-1) in mussels, Mytilus spp. The selected concentrations implemented in both exposure types were defined based on values found in the aquatic environment and are therefore ecologically relevant. The analysis of toxicological effects was carried out by evaluating several parameters of oxidative stress (activities of the enzymes superoxide dismutase and catalase), biotransformation (activity of the isoenzymes glutathione S-transferases) and lipid peroxidation (levels of thiobarbituric acid reactive substances). These parameters were evaluated in three tissues, the gills, the digestive gland, and the muscle. A genotoxicity parameter was also evaluated by the comet assay in the haemolymph and finally a parameter to evaluate the influence of the drugs on the shell hardness of the exposed organisms. In the case of oxytetracycline, this antibiotic caused oxidative damage in the gills of organisms exposed for 28 days at the four highest concentrations (0.625, 1.25, 2.5, and 5 μgL-1). With regard to the genotoxicity biomarkers, an increase in genotoxic damage could be observed with increasing concentrations for both acute and chronic exposure. However, for the biomarker of shell hardness, no effects were observed after exposure to this antibiotic, but a decreasing trend in shell hardness is noteworthy for chronic exposure to oxytetracycline. Exposure to ciprofloxacin resulted in oxidative damage for the three highest concentrations (0.031, 0.078 and 0.195 mgL-1), in the digestive gland of mussels exposed for 28 days to this antibiotic. Acute and chronic exposure to this antibiotic was able to induce genotoxicity in the exposed organisms, with an increase characterized by an increasing dose-response pattern for both exposures. For the parameter of shell hardness, no changes were recorded in the exposed organisms regardless of the exposure time. The mixture of the two antibiotics was made taking into consideration concentrations causing effects in the isolated exposures, however for none of the exposures was it possible to observe oxidative damage despite changes in antioxidant defences. However, the mixture of these two antibiotics was shown to be capable of causing genotoxic damage for both the acute and chronic exposures, and an increase in damage could be observed with increasing concentration of the mixture. Again, for the shell hardness parameter no change was observed after both exposures. This set of data allows us to infer and reinforce the need to evaluate the effects that these compounds may have on non-target organisms. Both antibiotics were shown to be capable of causing deleterious effects to exposed organisms as well as their mixture. The exposure capable of causing the most deleterious effects was oxytetracycline. However, with the results of all the exposures we can conclude that these drugs induce changes in exposed organisms that can result in consequences for the populations, and that it is of extreme ecological importance to evaluate the impact of these types of substances.

Os antibióticos são uma classe de fármacos amplamente utilizada pelo mundo inteiro para tratar infeções, quer em humanos como em animais. Devido ao seu amplo uso, estes fármacos acabam por ser libertados no ambiente, uma vez que as estações de tratamento de águas residuais não são eficientes na sua eliminação. Isto faz com que estes compostos se encontrem amplamente distribuídos em ambientes aquáticos, justificando a crescente preocupação quanto ao impacto que os mesmos podem ter nas espécies lá presentes. Dessa forma, este trabalho visa caracterizar a toxicidade decorrente da exposição aguda (96h) e crónica (28 dias) a dois antibióticos, oxitetraciclina (0, 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5 e 5 μgL-1) e ciprofloxacina (0, 0.005, 0.013, 0.031, 0.078 e 0.195 mgL-1) e a sua mistura (0, 0.005 mgL-1 CIP + 0.3125 μgL-1 OTC, 0.031 mgL-1 CIP + 1.25 μgL-1 OTC, e 0.195 mgL-1 CIP + 5 μgL-1 OTC) em mexilhões, Mytilus spp. As concentrações selecionadas implementadas nos dois tipos de exposição foram definidas tendo por base valores encontrados em ambiente aquático, sendo, portanto, ecologicamente relevantes. A análise dos efeitos toxicológicos foi efetuada pela avaliação de diversos parâmetros de stress oxidativos (actividades das enzimas superóxido dismutase e catalase), de biotransformação (atividade das isoenzimas glutationa S-transferases) e peroxidação lipídica (níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico). Estes parâmetros foram avaliados em três tecidos, nas brânquias, na glândula digestiva e no músculo. Foi também avaliado um parâmetro de genotoxicidade através do teste do cometa na hemolinfa e por último um parâmetro para avaliar a influência dos fármacos na dureza da concha dos organismos expostos. No caso da oxitetraciclina, este antibiótico causou dano oxidativo nas brânquias dos organismos expostos durante 28 dias às quatro concentrações mais altas (0.625, 1.25, 2.5, and 5 μgL-1). No que diz respeito aos biomarcadores de genotoxicidade, foi possível observar um aumento do dano genotóxico com o aumento das concentrações, quer para a exposição aguda como para a crónica. Contudo, para o biomarcador da dureza das conchas, nenhuns efeitos foram observados após exposição a este antibiótico, mas é de salientar uma tendência de diminuição da dureza das conchas para a exposição crónica a oxitetraciclina. A exposição a ciprofloxacina resultou em dano oxidativo para as três concentrações mais altas (0.031, 0.078 e 0.195 mgL-1), na glândula digestiva dos mexilhões expostos durante 28 dias a este antibiótico. A exposição aguda e crónica a este antibiótico foi capaz de induzir nos organismos expostos genotoxicidade, com um aumento caracterizado por um padrão dose-resposta crescente para ambas as exposições. Para o parâmetro da dureza das conchas não foram registadas alterações nos organismos expostos, independentemente do tempo de exposição. A mistura dos dois antibióticos foi feita tendo em consideração concentrações causadoras de efeitos nas exposições isoladas, contudo para nenhuma das exposições foi possível observar dano oxidativo apesar de alterações nas defesas antioxidantes. Contudo, a mistura destes dois antibióticos mostrou ser capaz de causar danos genotóxicos, quer para a exposição aguda como para a crónica, sendo possível observar um aumento do dano com o aumento da concentração da mistura. Mais uma vez, para o parâmetro da dureza das conchas nenhuma alteração foi observada, após ambas as exposições. Este conjunto de dados permitem-nos inferir e reforçar a necessidade de avaliar os efeitos que estes compostos podem ter em organismos não-alvo. Ambos os antibióticos mostraram-se potenciais indutores de efeitos deletérios aos organismos expostos bem como a sua mistura. A exposição capaz de causar mais efeitos deletérios foi a oxytetraciclina. Contudo com os resultados de todas as exposições podemos concluir que estes fármacos induzem alterações nos organismos expostos podendo resultar em consequências para as populações, sendo de extrema importância ecológica a avaliação do impacto deste tipo de compostos.