Production and purification of pDNA as a biopharmaceutical with application in oncolog

Abstract

This work reports the development of an upstream and downstream process to recover a model plasmid DNA (pDNA) with potential application in gene therapy, particularly targeting breast cancer. After the pDNA production, aqueous biphasic systems (ABS) were investigated to as a recovery and purification technique. The ABS composed of the tetrabutylphospnium bromide ([P4444]Br) ionic liquid (IL) and potassium citrate salt (C5H6K3O7·H2O) was identified as the most promising system promoting the isolation of pDNA with high purity. The partitioning behaviour of pDNA and ribonucleic acid (RNA) showed that for low concentrations of salt and IL, both classes of nucleic acids exhibit a tendency to be preferentially partitioned toward the bottom phase, mainly enriched in potassium citrate salt. However, and by properly engineering the concentration of both phase-forming components, at the mixture point composed of 25 wt% of [P4444]Br and 25 wt% of K3C6H5O7, pDNA was selectively recovered in the salt-rich phase with high purity. It was observed that pDNA is mostly recovered in its supercoiled isoform, and that the content of total proteins was reduced by 13% in comparison with the bacterial lysate sample. Also, purified pDNA exhibited the ability to confer resistance to Escherichia coli cells after heat-shock transformation, further supporting that it is purified with high integrity and functionality. Overall, a promising IL-based ABS technology for the purification of pDNA from bacterial lysates was developed in this work, in which the presence of IL seems to be responsible for upgrading the pDNA purity over some conventional systems. Envisaging the production of pDNA for gene therapy, future work should comprise the evaluation of the biological activity of purified pDNA and the assessment of endotoxin levels.

O presente trabalho reporta a utilização de um processo a montante e a jusante para a produção de ácido desoxirribonucleico plasmídico (ADNp) modelo com potencial aplicação em terapia genética, com especial aplicação no tratamento de cancro de mama. Após a produção, estudaram-se sistemas aquosos bifásicos (SAB) como técnica de purificação e recuperação de ADNp. O SAB composto pelo líquido iónico (LI) brometo de tetrabutilfosfónio ([P4444]Br) e o sal citrato de potássio (C5H6K3O7·H2O) foi identificado como o sistema mais promissor tendo em vista a sua capacidade para promover o isolamento de ADNp com elevada pureza. O comportamento de partição de ADNp e ácido ribonucleico (ARN) mostrou que para concentrações mais baixas de sal e LI, ambas as classes de ácidos nucleicos exibem uma tendência para serem, preferencialmente, particionadas para a fase inferior do SAB, rica em sal. No entanto, e através da otimização da concentração de ambos os componentes formadores de fase, no ponto de mistura de 25% (m/m) de [P4444]Br e 25% (m/m) de C5H6K3O7·H2O, o ADNp foi seletivamente recuperado na fase rica em sal com elevada pureza. O ADNp foi recuperado principalmente na sua isoforma superenrolada, e o conteúdo em proteínas totais foi reduzido em 13% quando comparado com a amostra de lisado bacteriano. Além disso, verificou-se que o ADNp purificado apresenta a capacidade de conferir resistência a células de Escherichia coli após a transformação por choque térmico, o que vem reforçar que este é purificado com elevada integridade e numa forma funcional. De uma forma global, foi desenvolvida uma tecnologia promissora baseada em SABs contendo LIs para a purificação de ADNp a partir de lisados bacterianos, na qual a presença do LI é responsável pelo melhoramento da pureza do ADNp em comparação com alguns sistemas convencionais. Estudos futuros deverão compreender a avaliação da atividade biológica do ADNp purificado, bem como a avaliação dos níveis de endotoxinas, visando a obtenção de ADNp com potencial aplicação em terapia genética.