Unveiling the neurotoxicity of inorganic and organic mercury in fish optic tectum: a morphometric and histopathological study

Abstract

The optic tectum is a brain area that has been pointed out as particularly vulnerable in fish to inorganic mercury (iHg) and methylmercury (MeHg). The structural and functional integrity of this area is central for the maintenance of several behaviours including food search, predator escape and reproduction and is thus vital for fish survival. The current state of the art has knowledge gaps concerning the effects of iHg and MeHg on the optic tectum morphology, specifically in relation to these research questions: i) do iHg and MeHg differently affect specific layers of the optic tectum? ii) do iHg and MeHg target preferentially neurons or glial cells (or both indistinctly)? iii) is the optic tectum able to recover from iHg and MeHg exposure? iv) what is the most toxic form of Hg (iHg vs. MeHg) in the optic tectum? To answer these questions, two experiments exposing juvenile white seabream (Diplodus sargus) were performed under this dissertation, comprising both exposure (7 and 14 days; E7 and E14, respectively) and post-exposure (28 days; PE28) periods, namely: i) waterborne exposure to inorganic HgCl2 (2 μg L-1) and ii) dietary exposure to MeHg (8.7 μg g-1). Morphometric assessments were performed using stereological methods where the layers of the optic tectum were outlined, while its area as well as the number of neurons and glial cells were quantified. The histopathological analyses were performed per section and per layer of the optic tectum. ImageJ was used to outline and calculate the area analysed for posterior adjustment of results to the total area of each layer. Results showed that iHg exposure did not trigger the loss of neurons during the exposure periods (E7 and E14), while a decrease of glial cells was detected in a single layer of the optic tectum at E14. In the MeHg experiment, a decrease on the number of neurons and glial cells was found in several layers of the fish optic tectum during the exposure period. In the post-exposure timepoint (PE28), while both Hg forms triggered the loss of neurons, while only MeHg exposure led to a decrease on the number of glia cells. Histopathology pointed out a higher toxicity of MeHg in the optic tectum layers, particularly in the post-exposure period, while no significant alterations were found in fish previously exposed to iHg. Importantly, both forms of Hg target preferentially neurons rather than glial cells in the optic tectum. Additionally, it was difficult to perceive if Hg forms target specific layers of the optic tectum. Current findings point out iHg and MeHg as relevant neurotoxicants, with MeHg exposure leading to a higher neurotoxicity than iHg in the optic tectum of fish. After 28 days of post-exposure, neurotoxic effects of iHg and MeHg remained prominent, suggesting long-term effects of these Hg forms. Accordingly, the neurotoxic effects of iHg and MeHg in the fish optic tectum are hardly reversible over time, eventually compromising the fish well-being and survival. Moreover, the health condition of fish should be followed for several months after exposure to Hg forms.

O tecto óptico é uma área do cérebro que tem sido referida como particularmente vulnerável à exposição a iHg e MeHg em peixes. A integridade estrutural e funcional desta área é importante para a manutenção de diferentes comportamentos, sendo vital à sobrevivência dos peixes uma vez que está relacionada com a procura de alimento, fuga de predadores e reprodução. O atual estado de arte apresenta lacunas relativas aos efeitos morfológicos no tecto óptico desencadeados pela exposição de peixes a iHg e MeHg, nomeadamente: i) O iHg e o MeHg afetam de forma diferente as várias camadas do tecto óptico? ii) As formas de Hg afetam preferencialmente neurónios ou células da glia (ou ambos os tipos de células de forma idêntica)? iii) Será o tecto óptico capaz de recuperar da toxicidade desencadeada pelo iHg e MeHg em 28 dias de pós-exposição? iv) Qual a forma de Hg (iHg ou MeHg) mais tóxica para o tecto óptico? Com o objetivo de responder a estas questões, esta dissertação compreendeu duas experiências de exposição de sargos (Diplodus sargus) juvenis a HgCl2 através da água (2 μg L-1) e a MeHg (8.7 μg g-1) através do alimento dos peixes, por períodos de 7 e 14 dias (E7 e E14, respetivamente) de exposição e 28 dias de pós-exposição (PE28). As análises morfométricas foram realizadas através de métodos estereológicos usados para delinear e quantificar as camadas do tecto óptico, assim como para a contagem de neurónios e células da glia. As análises histopatológicas foram realizadas por secção e por camada. O programa ImageJ foi usado para delinear e calcular a área analisada para posterior ajuste à área total de cada camada. Os resultados demonstram que a exposição a iHg não conduziu à perda de neurónios durante o período de exposição (E7 e E14), enquanto uma diminuição de células da glia foi registada numa única camada do tecto óptico no período E14. Na experiência do MeHg, verificou-se a diminuição do número de neurónios e células da glia em diversas camadas do tecto óptico dos peixes durante o período de exposição. No período de pós-exposição (PE28), as duas formas de Hg induziram perda de neurónios, enquanto apenas a exposição a MeHg conduziu à perda de células da glia. A histopatologia sinalizou uma maior toxicidade do MeHg nas camadas do tecto óptico, particularmente no período de pós-exposição, sendo que não foram detetadas alterações significativas na exposição a iHg. Especificamente, foi possível demonstrar que ambas as formas de Hg têm como alvo preferencial os neurónios no tecto óptico dos peixes. Adicionalmente, os resultados não permitiram distinguir se alguma das camadas do tecto óptico é particularmente afetada pela exposição a cada uma das formas de Hg. Além disso, estes resultados apontam o iHg e o MeHg como neurotóxicos relevantes em peixes, sendo que a exposição a MeHg desencadeou uma maior toxicidade no tecto óptico em comparação com a exposição a iHg. Após 28 dias de pós-exposição, os efeitos neurotóxicos do iHg e do MeHg mantiveram-se proeminentes sugerindo um efeito prolongado destas duas formas de Hg. Assim, os efeitos neurotóxicos do iHg e MeHg no tecto óptico parecem ser dificilmente reversíveis, o que poderá comprometer o bem-estar e a sobrevivência do peixes. Ademais, a condição de saúde dos peixes deverá ser seguida ao longo de vários meses após a exposição às formas de Hg.