Identification of reagents intended to the study of the long isoform of the NF-YA transcription factor

Abstract

Transcription factors are proteins involved and vital to several cellular processes and cell identity. The binding of these proteins to the specific DNA elements is what makes it so important, regulating the transcriptome of all cells. The nuclear factor Y is a protein classified as a pioneer TF, binding to the CCAAT box promoter element. This NF is composed by three different and preserved subunits NF-YA, NF-YB and NF-YC. NF-YA is the regulatory subunit and is composed by 347 aminoacids in its long isoform (NF-YAl). The NF-YA gene expression generates in fact, by alternative splicing, two main isoforms, differing in 28 aminoacids, corresponding to the exon 3. Due to the essential role this nuclear factor plays in many cellular processes it is crucial the deepening of the knowledge about its physiological and pathological functions, in particular regarding the differential expression of the different isoforms of NF-YA. In this project, which initially started after two rabbits were immunized with NF-YAl, we performed experiments to obtain NF-YA long specific antibody reagents, essential to distinguish both isoforms in further experiments. This project aims included the production and purification of recombinant proteins for the subsequent affinity purification of the specific antibodies. To accomplish the main objective, the project started with the preparation of bacterial competent cells for transformation with the relevant expression plasmids, followed by setting the induction and purification protocols for protein production. After the required amount of protein was obtained, we proceeded to the final steps of the project with experiments of western blot and affinity chromatography of rabbit sera. The elution fractions obtained by affinity chromatography purifications were subsequently tested and analysed by western blot, to verify the specificity of NF-YAl antibodies. The principal aim was achieved with success, having as a final positive result in two elution fractions, corresponding to a specific pH of the affinity chromatography, which included antibodies specific to the long isoform of NF-YA.

Fatores de transcrição (FT) são proteínas envolvidas e vitais em diversos processos celulares e na própria identidade celular. A ligação destas proteínas a elementos específicos de ADN é o que faz com que sejam tão essenciais, regulando o transcriptoma de todas as células. O fator nuclear Y é uma proteína classificada como um fator de transcrição pioneiro, ligando-se à sequência CCAAT do promotor. Este FT é composto por três diferentes e preservadas subunidades NF-YA, NF-YB e NF-YC. O NF-YA é a subunidade reguladora, composta por 347 aminoácidos na sua isoforma longa (NF-YAl). A expressão genética do NF-YA gera, por splicing alternativo, duas fundamentais isoformas, que diferem em 28 aminoácidos, correspondentes ao exão 3. Devido à função essencial que este fator nuclear desempenha em vários processos celulares é crucial o alargamento do conhecimento sobre as suas funções fisiológicas e patológicas, em particular no que diz respeito à expressão diferencial das diferentes isoformas do NF-YA. Neste projeto, que inicialmente começou após dois coelhos serem imunizados com NF-YAl, desenvolveram-se ensaios para obter reagentes de anticorpos específicos para isoforma longa de NF-YA, essenciais para distinção de ambas as isoformas em experiências futuras. O objetivo deste projeto inclui a produção e purificação de proteínas recombinantes para a purificação de afinidade de anticorpos específicos. De modo a alcançar o objetivo principal, o projeto começou com a preparação de células bacterianas competentes para transformação com os plasmídeos de expressão relevante, seguido pela configuração dos protocolos de indução e purificação para a produção proteica. Após a aquisição da quantidade suficiente de proteína, procedemos às etapas finais do projeto, com ensaios de western blot e cromatografia de afinidade do sera de coelho. As soluções de eluições obtidas pelas purificações de cromatografia de afinidade foram, posteriormente, testadas e analisadas através de experimentos de western blot, de modo a verificar se os anticorpos específicos para NF-YAl eram, de facto, específicos. O principal objetivo do projeto foi atingido com sucesso, alcançando como resultado final positivo duas eluições correspondentes a um pH específico da cromatografia de afinidade, contendo anticorpos específicos para a isoforma longa de NF-YA.