Ecotoxicological effects of a “smart” engineered nanomaterial in zebrafish

Abstract

Layered Double Hydroxides (LDH) are anionic nanoclays, composed of positively-charged layers with divalent or trivalent metal cations (e.g., Zn2+ or Al3+) and stabilized by anions (e.g., nitrates) and water molecules in the interlayers. LDHs have remarkable properties namely excellent anion exchangeability, memory effect, biocompatibility, pH sensitivity, high surface to volume ratio, and high adsorbing capacity. LDHs have been regarded as “smart” engineered nanomaterials and lately received great interest in multiple areas, such as medicine, pharmaceutical, industry, among others. These nanomaterials are of low toxicity to humans, mammals, and marine organisms. However, ecotoxicological effects on freshwater organisms are scarcely studied, which is critical for regulatory purposes. The zebrafish Danio rerio is a wellestablished freshwater model organism that is widely used in toxicological and ecotoxicological assessment of innumerous contaminants. Several studies are using the zebrafish to evaluate the toxicity of nanomaterials, mainly metallic nanoparticles. The present study aimed to assess the ecotoxicological effects of Zn-Al LDH in Danio rerio. Danio rerio eggs were exposed to Zn-Al LDHs to assess developmental, behavioural, biochemical, and molecular (at the DNA level) changes. For the evaluation of embryotoxicity, the eggs were exposed to Zn-Al LDH (85 - 1200 mg/L) according to the OECD 236 protocol, where mortality, malformations, and hatching success were recorded daily for 96 hours. In the behavioural test, the embryos were exposed to sublethal concentrations of Zn-Al LDH (9 - 94 mg/L) for 120 h. The evaluation of genotoxicity (comet assay) and biomarkers of neurotoxicity and oxidative stress after a 96 h exposure of eggs to nanomaterial (9 - 94 mg/L). The behaviour and fate of LDHs in the water of the zebrafish system were characterized through the zeta potential and hydrodynamic particle size.

Os hidróxidos duplos lamelares (LDH) são nanoargilas aniónicas, compostas por camadas carregadas positivamente com catiões metálicos divalentes ou trivalentes (por exemplo, Zn2+ ou Al3+) e estabilizados por aniões (por exemplo, nitratos) e moléculas de água entre camadas. Estes nanomateriais têm propriedades notáveis, nomeadamente excelente permutabilidade aniónica, efeito de memória, biocompatibilidade, capacidade de resposta a alterações do pH, elevada relação superfície/volume e elevada capacidade de adsorção. Os LDH têm sido considerados nanomateriais manufaturados “inteligentes” e têm recebido um forte interesse em áreas como a medicina, farmacêutica, indústria, entre outras. Estes nanomateriais causam baixa toxicidade em humanos, mamíferos e organismos marinhos. No entanto, os efeitos ecotoxicológicos em organismos de água doce são pouco estudados, lacuna esta que é crítica para fins regulatórios. O peixe-zebra Danio rerio é um organismo-modelo de água doce amplamente utilizado na avaliação (eco)toxicológica de inúmeros contaminantes. Existem vários estudos que utilizam o peixe-zebra para avaliar a toxicidade de nanomateriais, principalmente nanopartículas metálicas. O presente estudo visa assim avaliar os efeitos ecotoxicológicos do nanomaterial LDH Zn-Al fases larvares da espécie Danio rerio. Para o efeito, ovos de Danio rerio foram expostos a LDH Zn-Al para avaliar a embriotoxicidade e alterações de desenvolvimento, comportamentais, bioquímicas e moleculares (ao nível do DNA). Para a avaliação da embriotoxicidade, os ovos foram expostos a LDH Zn-Al (85 – 1200 mg/L) de acordo com o protocolo OCDE 236, onde a mortalidade, malformações e sucesso de eclosão foram registados diariamente durante 96 h. No ensaio comportamental, os embriões foram expostos a concentrações subletais de LDH Zn-Al (9 – 94 mg/L) durante 120 h. A avaliação da genotoxicidade (ensaio do cometa) e de biomarcadores de neurotoxicidade e de stress oxidativo foi realizada após uma exposição de 96 h dos ovos ao nanomaterial (9 – 94 mg/L). O comportamento e destino dos LDH na água do sistema do peixe-zebra foram avaliados através do potencial zeta e tamanho hidrodinâmico das partículas. No geral, as dispersões de LDH têm tendência para agregação e reduzida estabilidade no meio de exposição. No teste de embriotoxicidade, a concentração de efeito não observada (CENO) foi de 415.2, 244.3 e 143.7 mg/L para os parâmetros de letalidade, eclosão e malformações, respetivamente. Em termos comportamentais, a exposição aos LDH causou diferenças significativas na duração total da locomoção (CEO= 9 mg/L). A exposição aos nanomateriais não causou genotoxicidade, nem diferenças significativas nos parâmetros bioquímicos testados (p > 0.05). Em conclusão, os resultados atuais sugerem que o Zn-Al LDH é pouco tóxico para embriões e larvas de peixe-zebra. Os efeitos observados parecem indicar um modo de atuação iminentemente físico/mecânico, compatível com a tendência para sedimentação em concentrações muito elevadas e pouco realistas (na ordem das dezenas de mg/L).