Phosphorylation mediated events in biomarker discovery for Alzheimer’s disease

Abstract

Alzheimer´s disease (AD) is one of the most common forms of dementia worldwide; representing 60-70% of all dementia cases. This neurodegenerative disorder is characterized by the presence of senile plaques (SPs), neurofibrillary tangles (NFTs) and synaptic loss. Amyloid-β peptide (Aβ), the major constituent of SPs, is a fundamental player in AD, since it can trigger several pathogenic events such as neurotoxicity and activation of inflammatory and apoptotic cascades. All these events associate with neurodegeneration and consequently gradual cognitive decline are evident in AD patients. Abnormal phosphorylation is accepted as one of the key signaling transduction mechanism involved in AD pathogenesis. In fact, several studies have reported abnormal protein kinase and protein phosphatase activities in AD brains as well as abnormal phosphorylation levels of both amyloid precursor protein (APP) and Tau protein, two proteins in the genesis of SPs and NFTs. This thesis aimed to address how phosphorylation mediated events could impact the neuronal phosphoproteome, thereby unravelling novel disease molecular targets. To achieve this, two distinct models were employed: one using okadaic acid, a protein phosphatase inhibitor and a potent neurotoxin; and the other using the neurotoxic Aβ peptide as a relevant AD specific mimicking model. In both cases, several phosphoproteins were identified. Neuronal treatment with OA lead to the recovery of 245 phosphoproteins that significantly increased and 75 phosphoproteins that significantly decreased; while exposure to Aβ resulted in 73 phosphorylated proteins that increased, and 68 that decreased in response to peptide exposure. In addition, due to the key role played by Aβ in AD, its effect on the phosphorylation state of the two key proteins in AD, APP (at Thr668 residue) and Tau (at Ser262 and Ser396 residues), were also evaluated. Data shows that Aβ itself can impact the phosphorylation state of both proteins, and thus, by affecting APP phosphorylation and potential APP processing, it can contribute to its own production. Taken together these findings suggest that Aβ plays a fundamental role in abnormal protein phosphorylation, potentially leading to abnormal signaling cascades, and consequently contributing to AD pathology. Interestingly, this work also unravels several candidates that can contribute to our understanding of the molecular mechanisms underlying AD pathology, but more so it identified novel putative biomarker candidates that can open avenues for the development of future diagnostic and therapeutic tools.

A doença de Alzheimer (DA) é uma das formas mais comuns de demência em todo o mundo representando 60-70% de todos os casos de demência. Esta doença neurodegenerativa é caracterizada pela presença de placas senis (PSs), emaranhados neurofibrilares (TNFs) e por perda sináptica. O peptídeo Aβ, principal constituinte das PSs, é fundamental na DA, dado que pode desencadear vários eventos patogénicos, como neurotoxicidade e ativação de cascatas inflamatórias e apoptóticas. Todos estes eventos estão associados à neurodegeneração e, consequentemente, ao declínio cognitivo gradual evidente nos doentes. A fosforilação anormal é aceite como um dos principais mecanismos de transdução de sinais envolvidos na patogénese da DA. De facto, vários estudos relataram atividades anormais de proteínas cinase e fosfatase no cérebro de doentes, bem como níveis de fosforilação anormais das proteínas APP (proteína precursora da amiloide) e Tau, duas proteínas na génese das PSs e TNFs. Esta tese teve como objetivo avaliar de que modo eventos mediados por fosforilação podem ter impacto no fosfoproteoma neuronal, com o intuito de revelar novos alvos moleculares da doença. Para tal, dois modelos distintos foram aplicados: um deles utilizava o ácido ocadaico (AO), inibidor de proteínas fosfatase e potente neurotoxina; e outro que usava o peptídeo neurotóxico Aβ, como modelo relevante e mais específico da DA. Em ambos as situações, várias fosfoproteínas foram identificadas. O tratamento neuronal com AO levou à recuperação de 245 fosfoproteínas significativamente aumentadas e 75 fosfoproteínas significativamente diminuídas, enquanto a exposição ao Aβ conduziu ao aumento de 73 proteínas fosforiladas e à diminuição de 68, em resposta ao peptídeo. Adicionalmente, devido ao papel relevante desempenhado pelo Aβ na DA, os seus efeitos na fosforilação de duas proteínas-chave na DA, APP (no resíduo Thr668) e Tau (nos resíduos Ser262 e Ser396), foram também avaliados. Os resultados mostram que o Aβ pode alterar o estado de fosforilação de ambas as proteínas e, ao afetar a fosforilação da APP e potencialmente o seu processamento, pode contribuir para sua própria produção. Em conjunto, estes resultados sugerem que o Aβ desempenha um papel fundamental na fosforilação anormal de proteínas, ativando potencialmente cascatas de sinalização anormais e, consequentemente, contribuindo para a patologia da DA. Este trabalho revelou vários candidatos que podem contribuir para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à patologia da DA; mas, mais ainda, identificou novos potenciais biomarcadores que podem abrir caminho para o desenvolvimento de futuras ferramentas de diagnóstico e terapêutica para a doença.