Profiling the volatile exometabolome of Pedobacter lusitanus NL19

Abstract

The omics approaches, whether genomics, transcriptomics, proteomics and metabolomics constitute a set of excellent analysis tools that have been gaining relevance in the enormous amount of data generated and information provided. Metabolomics, defined as the detailed metabolome analysis, reveals the set of metabolites produced by a given organism, in a given condition and at a specific time/period of time. Microbial metabolomics is often used to provide information about the microbial metabolites produced by an organism, in a specific experimental environment/condition. Pedobacter lusitanus NL19 T (NL19 T ) has encoded in its genome, the information for the production of bioactive secondary metabolites (SMs). The range of compounds produced differs depending on the composition of the culture medium and this is particularly noticeable when the microorganism grows on PC 25%, a Tryptic Soy Broth (TSB) modified culture medium where the concentration of casein peptone is reduced to 25%. In addition, differences in the production profile of SMs were detected when compared to that of the phylogenetically close strain, Pedobacter himalayensis MTCC 6384T (MTCC 6384 T ), grown under the same conditions. Thus, the objective of this work is to understand the differences in volatile exometabolom es, of these two phylogenetically related species – strains NL19 T and MTCC 6384 T – in PC 25% and TSB 100%. To do so, we used the advantages of the combined HS -SPME/GC×GC -ToFMS methodology. A total of 325 compounds were identified. Of these, only 78 were considered statistically significant in the test conditions compared to the control conditions. 42 compounds differentiate the profile of the strains NL19 T and MTCC 6384 T in TSB100% and 11 differentiate the profile of the same strains in PC25%. The MTCC 6384 T strain has a greater abundance of compounds that are involved in the metabolism of pyruvate, amino acids, fatty acids, aromatic compounds and in the mevalonate pathway through geranylPP and farn e s ylPP. The detailed analysis of the compounds that present greater variability in the two media tested and for each strain identified 16compounds, of the metabolic pathways of amino acid and fatty acid metabolism and monoterpene biosynthesis. These present statistically different concentrations between the two media and in the two microorganisms. A second objective of this work was to understand if the volatile compounds (mVOCs) produced by NL19T strain, growing on TSB, interfere with the growth of Candida albicans I-11301. A new methodological approach made it possible to evaluate the effect of volatile compounds produced during the growth of strain NL19 in liquid medium with simultaneous growth of C. albicans on solid medium. At defined time intervals (24h, 48h, 72h, 96h, 120h and 144h) the emitted volatile compounds were analysed and the morphological changes in the yeast were observed. It was found that the mVOCs produced by NL19 T strain induce morphogenesis in C. albicans that assumes a filamentous morphology, possibly associated with virulence. The analysis of the mVOCs by HS -SPME/GC×GC - ToFMS under different conditions revealed the presence of 134 compounds, the majority of which are carbohydrates, ketones and alcohols . Of these, only 33 were analyzed in greater detail, as they increased or decreased significantly over time, and included mostly carbohydrates, ketones and sulfur - containing compounds and esters. The compounds were separated into two sets: set 2, which included compounds that gradually increase over time and set 3, which corresponds to compounds that increase sharply over a period of time but then decrease. It was on these sets that we focused our analysis since these could be the compounds that contributed to the phenotypic changes observed in C. albicans. Thus, this analysis suggests that the compounds 2 -methylnonane, 3 -methylbutyl - 2 -methylbutanoate, S -methyl 2 -methylpropanetioate, hexan - 2 - one, S -methyl 3 -methylbutanetioate, isopentyl formate and penta -1,2 -diene, which are produced in high quantities, may be responsible for inducing morphogenesis in C. albicans. This study allowed the beginning of the construction of the omics pipeline since it made it possible to have a preliminary approach on the metabolom es that could complement other approaches such as genomics, transcriptomics and proteomics.

As abordagens ómicas sejam elas de genómica, transcriptómica, proteómica e metabolómica constituem um conjunto de excelentes ferramentas de análise que tem vindo a ganhar relevância enorme quantidade de dados gerados e informação fornecida. A metabolómica, definida pela análise detalhada do metaboloma, revela o conjunto de metabolitos produzidos por um dado organismo, numa determinada condição e num momento/período de tempo específico. A metabolómica microbiana é frequentemente usada para fornecer informação sobre os metabolitos microbianos produzidos por um organismo, num ambiente/ condição experimental concreto. Pedobacter lusitanus NL19T (NL19T ) tem codificada no seu genoma, a informação para a produção de metabolitos secundários (SMs) bioativos. A gama de compostos produzidos difere consoante a composição do meio de cultura e isso é particularmente notório quando o microrganismo cresce em PC 25% (meio TSB com peptona de caseína a 25%). PC 25% é um meio de cultura modificado do Tryptic Soy Broth (TSB), onde a concentração da peptona de caseína é reduzida de 100% para 25%. Para além disso, foram detetadas diferenças do perfil de produção de SMs quando comparado com o da estirpe filogeneticamente próxima, Pedobacter himalayensis MTCC 6384T (MTCC 6384T ), crescida nas mesmas condições. Assim, o objetivo deste trabalho é perceber as diferenças nos exometabolomas voláteis, destas duas espécies filogeneticamente relacionadas– estirpes NL19T e MTCC 6385T – nos meios PC 25% e TSB 100%. Para tal, recorremos às vantagens da metodologia combinada de HS-SPME/GC×GC-ToFMS. Um total de 325 compostos foram identificados. Destes, apenas 78 foram considerados estatisticamente significativos nas condições teste (amostras inoculadas com as estirpes em estudo) relativamente às condições controlo (apenas meio de cultura). 42 compostos diferenciam o perfil de estirpe NL19T e estirpe MTCC 6384T em TSB 100% e 11 diferenciam o perfil das mesmas estirpes em PC25%. A estirpe MTCC 6384T apresenta uma maior abundância de compostos que estão envolvidos no metabolismo de piruvato, de aminoácidos, de ácidos gordos, de compostos aromáticos e na via do mevalonato através de geranilPP e farnseilPP. A análise detalhada dos compostos que apresentam maior variabilidade nos dois meios testados e para cada estirpe identificou 16 compostos, das vias metabólicas do metabolismo de aminoácidos e ácidos gordos e biossíntese de monoterpenos. Estes apresentam concentrações estatisticamente diferentes entre os dois meios e nos dois microrganismos. Um segundo objetivo deste trabalho foi perceber se os compostos voláteis (mVOCs) produzidos por estirpe NL19T , a crescer em TSB, interferem com o crescimento de Candida albicans I-11301. Uma nova abordagem metodológica permitiu avaliar o efeito dos compostos voláteis produzidos durante o crescimento da estirpe NL19T em meio líquido no crescimento simultâneo e em meio sólido de C. albicans I-11301. Em intervalos de tempo definidos (24h, 48h, 72h, 96h, 120h e 144h) analisaram-se os compostos voláteis emitidos e observaram-se as alterações morfológicas na levedura. Verificou-se que os mVOCs produzidos induzem morfogénese em C. albicans I-11301 que assume uma morfologia filamentosa, possivelmente associada à virulência. A análise dos mVOCs por HS-SPME/GC×GC-ToFMS, nas diferentes condições, revelou a presença de 134 compostos, sendo a maioria destes hidratos de carbono, cetonas e álcoois. Destes, apenas 33 foram analisados com maior detalhe, por aumentarem ou diminuírem significativamente ao longo do tempo, e incluíam maioritariamente hidratos de carbono, cetonas e compostos contendo enxofre e ésteres. Os compostos foram separados em dois conjuntos: o conjunto 2, que incluiu compostos que aumentam gradualmente ao longo do tempo e o conjunto 3 que corresponde a compostos que aumentam bruscamente no início mas que depois vão diminuindo. Foi nestes conjuntos em que focámos a nossa análise visto poderem ser estes os compostos que contribuíram para as alterações fenotípicas observadas em C. albicans. Assim, esta análise sugere que os compostos 2-metilnonano, 3-metilbutil-2-metilbutanoato, S-metil 2- metilpropanetioato, hexan-2-ona, S-metil 3-metilbutanetioato, isopentil formato e penta-1,2-dieno, que são produzidos em quantidades elevadas, possam ser os responsáveis por induzir a morfogénese em C. albicans. Este estudo permitiu o início da construção da omics pipeline uma vez que possibilitou ter uma abordagem preliminar sobre os metabolomas que podem complementar outras abordagens como a genómica, transcriptómica e proteómica.