Phage therapy in the inactivation of A. hydrophila in bivalve molluscs

Abstract

The recurrent emergence of infections outbreaks associated with bivalve molluscs consumption is of extreme importance for public health. Aeromonas hydrophila is a human pathogen that is widely distributed in coastal areas, and is a causative agent of different diseases (e.g., gastroenteritis, wound infection, meningitis, endocarditis and septicaemia) in humans after consumption of contaminated seafood. Although bacterial elimination mostly depends on the depuration of bivalves, this process is not sufficiently safe and efficient to eliminate some microorganisms present in their tissues. The development and evaluation of new strategies with no adverse effects to bivalves, in order to reduce the concentration of potential human pathogens is therefore essential. One of the most promising approaches is to combine phage therapy with the depuration process. The use of bacteriophages (or phages) to control bacterial infections has been reported across numerous fields by many researchers. However, relatively the combination of depuration and phage therapy to eliminate pathogenic bacteria in bivalves there are only four studies, and these studies are restricted to three bacterial strains (Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium). Thus, the objective of this work was to evaluate the efficacy of three new phages to control A. hydrophila, in order to evaluate their potential application during depuration. Three new phages (AH-1, AH-4 and AH-5) were isolated and characterized in terms of host range, latent period, burst size, and development phage-resistant mutants. First, the phage-bacteria interaction was evaluated in vitro, using single suspensions of phages or phage cocktails. Time of treatment and the concentration of phage were also studied. The isolated phages, AH-1, AH-4 and AH-5, belonged to the Myoviridae family. In general, the increase of multiplicity of infection (MOI) from 1 to 1000 not promoted a significant increase in the efficiency of phage AH-1. The in vitro assays indicated that the use of phages AH-1, AH-4 and AH-5 can be an effective alternative to control of A. hydrophila, however, the phage AH-1 was the most efficient one (additional reduction of more 3 log CFU/mL) when compared with to the other two phages. The use of cocktails with two and three phages (AH-1/AH-4, AH-1/AH-5, AH4/AH-5 and AH-1/AH-4/AH-5) was lightly more effective (maximum reductions of 5.1-5.8 log CFU/mL) than the use of phages AH-4 and AH-5 alone (reductions of 4.9 and 4.5 log CFU/mL, respectively), however, the efficiency of phage AH-1 (maximum inactivation of 7.7 log CFU/mL) was significantly higher than the obtained with phage cocktails. Second, to confirm if the phage AH-1 can be used to control the A. hydrophila in bivalves, in vivo experiments, using artificially contaminated cockles were done. Depuration in static seawater at multiplicity of infection (MOI) of 1 with phage of AH-1 revealed a significantly decrease in the rate of A. hydrophila inactivation in cockles (1.0 log CFU/g) during treatment. Results indicated that combining phage biocontrol with depuration procedures enhance bivalve microbial safety for human consumption by improving decontamination efficiency, proving that this technology can be transposed to the bivalve industry.

O aparecimento recorrente de surtos infeciosos associados ao consumo de bivalves moluscos é de extrema importância para a saúde publica. Aeromonas hydrophila é uma bactéria patogénica amplamente distribuída nas zonas costeiras e é um agente causador de diferentes doenças (por exemplo, gastroenterite, infeção em feridas, meningite, endocardite e septicemia) no homem após o consumo de frutos do mar contaminados, nomeadamente bivalves. Embora a eliminação bacteriana dependa maioritariamente da depuração dos bivalves, este processo não é suficientemente seguro e eficiente para eliminar alguns microrganismos presentes nos tecidos dos bivalves. O desenvolvimento e avaliação de novas estratégias sem efeitos adversos para os bivalves, a fim de reduzir a concentração de potenciais agentes patogénicos, é, portanto, essencial. Uma das abordagens mais promissoras é a combinação da terapia fágica com a depuração. A eficácia da utilização de bacteriófagos (ou fagos) para controlar infeções bacterianas tem sido relatada em inúmeros estudos. No entanto, relativamente à utilização da terapia fágica para inativar bactérias patogénicas durante a depuração de bivalves, existe apenas quatro estudos, estando estes estudos restritos a três estirpes bacterianas (Vibrio parahaemolyticus, Escherichia coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium). Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a eficácia de três novos fagos para controlar A. hydrophila, de forma a estudar a sua potencial aplicação durante o processo de depuração. Foram isolados três novos fagos (AH-1, AH-4 e AH-5) que foram caracterizados em termos de gama de hospedeiros, período latente, número de explosão e desenvolvimento de mutantes resistentes aos fagos. Inicialmente, a interação fago-bactéria foi avaliada in vitro, utilizando suspensões individuais de fago e cocktails. O tempo de tratamento e concentração de fago a aplicar também foram estudados. Todos os fagos isolados, AH-1, AH-4 e AH-5 pertencem à família Myoviridae. Em geral, o aumento da multiplicidade de infeção (MOI) de 1 a 1000 não promoveu um aumento significativo na eficácia do fago AH-1. Os ensaios in vitro demonstraram que a utilização do fago AH-1, AH-4 e AH-5 pode ser uma alternativa eficaz no controlo de A. hydrophila, no entanto, o fago AH-1 foi mais eficaz (redução adicional superior a 3 log CFU/mL) quando comparado com os outros dois fagos. A utilização de cocktails com dois ou três fagos (AH-1/AH-4, AH-1/AH-5, AH-4/AH-5 e AH-1/AH-4/AH-5) foi ligeiramente mais eficaz (redução máxima de 5,1 a 5,8 log CFU/mL) do que a obtida com os fagos AH-4 e AH-5 (redução de 4,9 e 4,5 log CFU/mL, respetivamente), no entanto, a eficácia do fago AH-1 (inativação máxima de 7,7 log CFU/mL) foi maior do que a obtida com os cocktails de fago. Numa segunda fase, para confirmar se o fago AH-1 pode ser usado para controlar a A. hydrophila em bivalves, foram realizados ensaios in vivo utilizando berbigões artificialmente contaminados. A depuração num sistema estático com MOI de 1 usando o fago AH-1 levou a uma diminuição significativa (1,0 log CFU/g) na concentração de A. hydrophila nos berbigões. Os resultados indicam que a combinação do fago AH-1 com a depuração aumenta a segurança dos bivalves para consumo humano, melhorando a eficácia da descontaminação, sugerindo, que esta tecnologia pode ser aplicada na indústria de bivalves.