Development of biopolymeric-based microneedles for application in drug administration and interstitial fluid extraction

Abstract

Microneedles are arrays comprised of small needle-like projections, of micronsized dimensions. Microneedles were first conceptualized aiming to enable the transdermal administration of drugs and combining the advantages of subcutaneous injections with the simplicity of transdermal patches. These micron-sized structures disrupt the stratum corneum, creating transitory pores which facilitate drug permeation through skin, in a minimally invasive and painless way. Furthermore, by contacting with the upper dermis, the microneedles enable interstitial fluid absorption for analysis of metabolites. In particular, in the last few decades, the use of biopolymers to fabricate microneedles has gained much interest due to their biocompatibility, biodegradability and biomimetic features. Proper consideration needs to be placed onto the sustainable character of these biomaterials and the need to pursue environmentally sustainable practices. Hence, this work aims at studying the preparation, evaluation and application of innovative microneedles systems using biopolymers, namely polysaccharides and proteins, to answer to the need for developing biomaterials of high performance with reduced environmental impact. The first chapter gives a general introduction to the characteristics and properties of microneedles, followed by an overview of biopolymeric microneedles, focusing on their properties and applications. The second chapter of this thesis is focused on the development of microneedles for point-of-care diagnostics, using methacryloyl gelatin (10% (w/v)). These microneedles have high swelling ability, which allows interstitial skin fluid absorption that is afterwards extracted and used for analysis of metabolites. To infer about the diagnostic potential, an agarose in vitro system was employed for urea extraction as a model analyte. Two different concentrations were tested, to mimic a health and (renal) disease state, and it was concluded that >98% analyte was recovered. In this sense, the cytocompatibility of this material coupled with the fluid uptake ability supports the application of methacryloyl gelatin microneedles as a diagnostic tool, offering a promising alternative in this era of point of care diagnostics. Aiming at developing new platforms for drug administration, the third chapter of this thesis describes the preparation and characterization of pullulan microneedles, using 6, 9, 12, 15, 18 e 24% (w/v) of polymer solutions. These presented a regular and uniform geometry and the microneedles prepared with 24% (w/v) pullulan were selected for insulin incorporation and evaluation of the functional properties. The insulin-loaded pullulan microneedles presented a regular morphology and 500 μm in length, mechanically strong to insert human skin ex vivo, creating pores up to 381 μm depth. The conformational stability of insulin into the pullulan system was confirmed through circular dichroism, during one month of storage at 4, 20 and 40 ºC. Therefore, it was possible to highlight the ability of pullulan microneedles to store and deliver this therapeutic agent with no need of cold chain monitoring. In the fourth chapter, the potential of bacterial nanocellulose as a mechanical reinforcement and macromolecular support for the incorporation of bioactive compounds (rutin) was studied using hyaluronic acid (5% (w/v)) microneedles for cosmetics. The antioxidant activity of this phenolic was kept for six months storage of microneedles at room temperature in the dark. Rutin permeation was evaluated using Franz cells and pig skin samples. In addition, the safety of the model system incorporating only bacterial cellulose and hyaluronic acid was evaluated by 13 human volunteers. Redness, erythema and transepidermal water loss in volunteer’s skin were evaluated and no statistical differences were found between the control and the application site, confirming the safety of the system. In a different perspective, the fifth chapter focuses on the preliminary evaluation of gelatin and pectin microneedles for curcumin incorporation, envisioning their potential application in melanoma treatment. The preparation of gelatin-pectin microneedles is described, aiming to evaluate the impact of the polymeric composition on the morphology and mechanical performance. Microneedles prepared with 75% gelatin and 25% pectin were selected for the incorporation of curcumin. Cell viability of three melanoma cell lines was evaluated for different curcumin concentrations, to study the dose-response curve. At this stage, it was defined an IC50 for each cell line and defined the amount of 10 μg curcumin to incorporate into the microneedles systems. Preliminary evaluation highlights the potential for curcumin incorporation into these biopolymeric microneedles and its application as candidates for melanoma treatment. In conclusion, this PhD thesis reported the development of several innovative and functional biopolymeric microneedles systems. The outstanding versatility of biopolymeric microneedles, enabled the development of systems guided for the administration of bioactive compounds, namely insulin, rutin and curcumin. These systems proved to retain the bioactives’ biological activity and the microneedles mechanical stability. The intumescent character of methacryloyl gelatin revealed their potential as a diagnostic tool, which represents a significant step in diagnostics and monitoring of healthcare state, especially for emergent and chronic diseases.

As microagulhas são sistemas constituídos por pequenas projeções em forma de agulhas, com dimensões na ordem dos micrómetros. As microagulhas foram conceptualizadas com o objetivo de administrar fármacos através da via transdérmica e combinar os benefícios das injeções subcutâneas com a simplicidade dos pensos transdérmicos. Estas microestruturas perfuram o estrato córneo e criam microporos transitórios que facilitam o transporte de compostos bioativos através da pele, de forma minimamente invasiva e indolor. Além disso, ao contactar com a região superior da derme, as microagulhas permitem recolher fluido intersticial para análise de diversos metabolitos. Em particular, nas últimas décadas, o estudo destes sistemas está muito direcionado para o desenvolvimento de microagulhas com polímeros naturais devido à sua biocompatibilidade e características biomiméticas. A utilização de biopolímeros assenta também no seu carácter biodegradável e na necessidade de implementar práticas sustentáveis neste domínio. Assim, este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento, caracterização e aplicação de sistemas de microagulhas inovadoras fabricadas a partir de biopolímeros, nomeadamente polissacarídeos e proteínas, de forma a responder à necessidade de desenvolver materiais de elevado desempenho e com um impacto ambiental reduzido. O primeiro capítulo apresenta as características e propriedades das microagulhas, seguida pela introdução e descrição das microagulhas biopoliméricas, com foco nas suas propriedades e aplicações. O segundo capítulo desta tese foca-se no desenvolvimento de microagulhas de gelatina metacrilatada (10% (m/v)) para utilização como ferramenta de diagnóstico. Estas microagulhas têm uma elevada capacidade de intumescimento e permitem a absorção de fluido intersticial, que é posteriormente extraído e utilizado para análise de metabolitos. A avaliação do potencial de extração destas microagulhas foi testado com um sistema modelo in vitro de agarose e utilizando a ureia como metabolito modelo. Foram testadas duas concentrações de ureia de forma a mimetizar condições normais e de doença (renal), e foi possível recuperar >98% do analito. A citocompatibilidade deste material, associada à sua capacidade de absorção de fluido suporta a utilização das microagulhas de gelatina metacrilatada como ferramenta de diagnóstico, oferecendo uma alternativa promissora na era de diagnóstico “point of care”. Com o intuito de desenvolver novas plataformas de administração de fármacos, o terceiro capítulo desta tese descreve a preparação e caracterização de microagulhas de pululano, utilizando soluções de 6, 9, 12, 15, 18 e 24% (m/v) de polímero. De uma forma geral, foram produzidas microagulhas de geometria regular e uniforme, tendo sido selecionadas as microagulhas de pululano com 24% (m/v) para a avaliação do potencial funcional deste sistema, através da incorporação de insulina. As microagulhas de pululano contendo insulina apresentam uma morfologia regular com microagulhas de 500 μm de altura e com resistência mecânica para perfurar pele humana ex vivo, atingindo até 381 μm de profundidade. A estabilidade da insulina no patch de microagulhas foi confirmada por dicroísmo circular, ao longo de um mês de armazenamento a 4, 20 e 40 ºC, tendo sido possível evidenciar a capacidade das microagulhas de pululano para armazenar e transportar este agente terapêutico sem recurso a climatização. No quarto capítulo, foi estudado o potencial de membranas de nanocelulose bacteriana como reforço mecânico e suporte macromolecular para a incorporação de compostos bioativos (rutina) em microagulhas fabricadas com ácido hialurónico (5% (m/v)) para aplicação na área da cosmética. A atividade antioxidante deste composto fenólico é mantida durante seis meses de armazenamento das microagulhas à temperatura ambiente e na ausência de luz solar. A permeação da rutina foi avaliada em células de Franz utilizando pele de porco e a segurança do sistema modelo, incorporando apenas ácido hialurónico e celulose bacteriana, foi testada em 13 voluntários humanos. A avaliação da vermelhidão, eritema e perda transepidérmica de água na pele dos voluntários não apresenta diferenças estatisticamente diferentes na região de aplicação e controlo, confirmando a segurança do sistema. Numa perspetiva diferente, o quinto capítulo foca-se num estudo preliminar de preparação e caracterização de microagulhas de gelatina e pectina com incorporação de curcumina para possível aplicação no tratamento do melanoma. A produção de microagulhas com gelatina e pectina iniciou-se com a avaliação do impacto de diferentes composições poliméricas na morfologia e nas propriedades mecânicas das microagulhas, tendo-se selecionado as microagulhas produzidas com 75% gelatina e 25% pectina para incorporar curcumina. A viabilidade celular de três linhas celulares de melanoma foi estudada para diferentes concentrações de curcumina, de forma a obter uma curva de dose-reposta. Nesta fase definiu-se o IC50 para as diferentes linhas celulares e a quantidade de curcumina (10 μg) a incorporar nos sistemas de microagulhas. Os resultados preliminares evidenciam o potencial da incorporação de curcumina em microagulhas biopoliméricas e a sua aplicabilidade como candidatas no tratamento de melanoma. Em conclusão, com este trabalho de doutoramento foram reportados sistemas de microagulhas biopoliméricos inovadores e funcionais. A elevada versatilidade das microagulhas constituídas por biopolímeros permitiu desenvolver sistemas direcionados para administração de compostos bioativos, nomeadamente insulina, rutina e curcumina. Estes sistemas demonstraram reter a atividade biológica dos compostos bioativos e a estabilidade mecânica das microagulhas. O carácter intumescente da gelatina metacrilatada revelou o seu potencial como ferramenta para extração de fluido intersticial, o que representa um avanço significativo no diagnóstico e monitorização do estado de saúde, especialmente para doenças emergentes e crónicas.