Please use this identifier to cite or link to this item:
http://hdl.handle.net/10773/30469
Title: | Characterization and development of aqueous biphasic systems envisioning their application in the purification of nucleic acids |
Other Titles: | Caracterização e desenvolvimento de sistemas aquosos bifásicos visando a sua aplicação na purificação de ácidos nucleicos |
Author: | Dinis, Teresa Beatriz Vide |
Advisor: | Martins, Guadalupe Freire Sousa, Fani Pereira de |
Keywords: | Aqueous biphasic system Ionic liquid Hydrogen bond basicity Extraction Mixtures Purification Stability Deoxyribonucleic acid |
Defense Date: | 3-Dec-2020 |
Abstract: | Non-viral vectors, such as plasmid deoxyribonucleic acid (pDNA), are gaining
momentum in gene therapy. However, the pDNA manufacture still requires the
development of cost-effective downstream bioprocesses, able to correspond to
all requirements of regulatory agencies and to provide high quantities of these
biotherapeutics at lower cost.
Amongst the possible downstream processes for pDNA, aqueous biphasic
systems (ABS) composed of ionic liquids (ILs) were investigated in this thesis,
since IL-based ABS allow to circumvent some technical limitations of the
traditional polymer-polymer and salt-polymer ABS, namely the lack of tailored
extraction performance and improved selectivity. Despite their potential, there is
still a deficiency in the investigation of IL-based ABS to purify nucleic acids.
Based on the exposed, this thesis starts with the development of a model to
predict the formation of IL-based ABS, which will allow their faster analysis and
design to a specific application, followed by the characterization of novel
IL-based ABS comprising mixtures of polymers or mixtures of ILs towards a
better understanding of the mechanisms ruling the ABS formation. These
fundamental studies are essential towards the optimization of IL-based ABS as
separation strategies. Finally, the implementation of IL-based ABS to purify
DNA-based therapeutics was investigated.
In this context, a new model, able to predict with good accuracy the formation of
IL-based systems, was developed, based on thermodynamic calculation models
and information taken from pure ILs. Thereafter, the determined phase diagrams
and partition coefficients of the two novel types of IL-based ABS comprising
mixtures of polymers or mixtures of ILs allowed to conclude that ABS with
mixtures of ILs do not behave as pseudo-ternary systems, contrarily to ABS
composed of mixtures of polymers. Based on the tunable character of IL-based
ABS, phase-forming components were successfully designed and demonstrated
to be able to preserve the DNA stability, while allowing the selective separation
of the deoxyribonuclease I (DNase I) enzyme from the target nucleic acid.
As evidenced in this thesis, IL-based ABS have the potential to perform
“one-pot” extraction, purification and long-term preservation of DNA, being
promising candidates to integrate several downstream steps in the pDNA
manufacture. Os vetores não-virais, tais como os ácidos desoxirribonucleicos plasmídicos (pADN), estão a ganhar relevância na terapia genética. No entanto, o bio processamento de pADN deve satisfazer as normas regulamentares e permitir a sua produção em elevada quantidade e a um menor custo. Entre os possíveis processos de extração e purificação de pADN, nesta tese foram estudados sistemas aquosos bifásicos (SAB) constituídos por líquidos iónicos (LI), uma vez que estes sistemas são capazes de “contornar” as principais limitações técnicas associadas aos SAB tradicionais compostos por polímeros e sais, nomeadamente baixa eficiência de extração e baixa seletividade. Apesar do seu potencial, os SAB constituídos por LIs têm sido ainda pouco estudados na purificação de ácidos nucleicos. Face ao exposto, a presente tese inicia-se com o desenvolvimento de um modelo capaz de prever a formação de SAB constituídos por LIs, que permita uma análise e seleção mais rápidas de um determinado SAB para uma aplicação específica, seguido da caracterização e otimização de novos SAB constituídos por misturas de polímeros ou misturas de LIs de forma a obter informação acerca dos mecanismos de formação destes sistemas. Estes estudos fundamentais permitem otimizar SAB constituídos por LIs enquanto processos de separação. Finalmente, foram implementados SAB constituídos por LIs na purificação de ADN. Neste contexto, foi desenvolvido um modelo capaz de prever com precisão a formação de SAB compostos por LIs, recorrendo a modelos de cálculo termodinâmico e propriedades de LIs puros. Os diagramas de fase e os coeficientes de partição determinados para os novos SAB constituídos por misturas de polímeros ou misturas de LIs permitiram concluir que os SAB constituídos por misturas de LIs não apresentam um comportamento de sistemas pseuso-ternários, contrariamente aos SAB com misturas de polímeros. Por fim, a comprovada versatilidade dos SAB constituídos por LIs permitiu identificar SAB capazes de assegurar a estabilidade do ADN e a separação da enzima desoxirribonuclease I do ácido nucleico. Tal como evidenciado nesta tese, os SAB constituídos por LIs apresentam potencial para extrair, purificar e preservar, simultaneamente, o ADN, sendo candidatos promissores para integrar vários passos no bio processamento de pADN. |
URI: | http://hdl.handle.net/10773/30469 |
Appears in Collections: | UA - Teses de doutoramento DQ - Teses de doutoramento |
Files in This Item:
File | Description | Size | Format | |
---|---|---|---|---|
Documento_Teresa_Dinis.pdf | 5.57 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.