The relevance of lipid accumulation in lysosomal storage diseases in immune cells function

Abstract

Lysosomal storage diseases (LSDs) are rare genetic diseases in which different molecules accumulate in the lysosome due to defects in lysosomal proteins. Fabry disease, Gaucher disease and Niemann-Pick disease type C (NPC) are LSDs, sphingolipidoses in which there is the accumulation of different sphingolipids in the lysosome while mucopolysaccharidoses (MPS) are characterized by the lysosomal accumulation of glycosaminoglycans. The lysosome is important in lipid antigen presentation mediated by CD1 molecules. In humans, four CD1 isoforms (CD1a, CD1b, CD1c and CD1d) are able to present lipid antigens, including sphingolipids, to a specific group of T cells, the CD1-restricted T cells. Invariant natural killer T (iNKT) cells are the most well characterized CD1-restricted T cells. In this thesis, it was investigated how the lysosomal alterations occurring in LSDs have an impact in the immune response, namely in CD1 lipid antigen presentation and in infection. CD1 lipid antigen presentation capacity was evaluated in monocytes and in monocyte-derived dendritic cells from LSD patients as well as the iNKT cell frequency. In Fabry, Gaucher, NPC and MPS VI diseases, monocyte-derived dendritic cells do not present defects in CD1b and CD1d lipid antigen presentation capacity and no alterations were found in iNKT cell frequency, contrarily to what was reported in several LSD mouse models. Also, in Fabry and Gaucher diseases, the monocyte CD1d lipid antigen presentation capacity was not decreased. In addition, the impact of different blood collection conditions in the CD1d lipid antigen presentation capacity of monocytes was investigated. Importantly, monocytes isolated 24 hours after blood collection in ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) presented a reduced capacity to activate iNKT cells, comparing to monocytes isolated 24 hours after blood collection in citrate. This finding is rather relevant in the field of CD1d lipid antigen presentation and highlights the importance of the anticoagulant chosen to perform monocyte functional assays. Macrophages are severely affected in Gaucher disease patients and human Gaucher disease macrophages presented an impaired capacity to fight bacterial infections. Herein, mouse Gaucher disease macrophages capacity of phagocytosing and eliminating Leishmania parasites was evaluated. It was used an in vitro model by treating mouse bone marrow-derived macrophages with an inhibitor of the enzyme β-glucocerebrosidase (Conduritol B epoxide), mimetizing the Gaucher disease. These Gaucher disease macrophages were able to internalize and kill the parasites, similarly to control cells. Altogether, these results contribute to increase the knowledge in LSDs and in CD1 lipid antigen presentation.

As doenças de sobrecarga lisossomal são doenças genéticas raras nas quais diferentes moléculas se acumulam no lisossoma devido a defeitos nas proteínas lisossomais. As doenças de Fabry, de Gaucher e a doença de Niemann-Pick tipo C (NPC) são doenças de sobrecarga lisossomal do tipo esfingolipidoses em que há a acumulação de diferentes esfingolípidos no lisossoma, enquanto que as mucopolissacaridoses (MPS) são caracterizadas pela acumulação lisossomal de glicosaminoglicanos. O lisossoma é importante na apresentação de antigénios lipídicos mediada pelas moléculas CD1. Nos humanos, quatro isoformas de CD1 (CD1a, CD1b, CD1c e CD1d) são capazes de apresentar antigénios lipídicos, incluindo esfingolípidos, a um grupo específico de células T, as células T restritas a CD1. As células “natural killer” T invariantes (iNKT) são as células T restritas a CD1 mais bem caracterizadas. Nesta tese, investigou-se como as alterações lisossomais que ocorrem nas doenças de sobrecarga lisossomal têm impacto na resposta imunitária, nomeadamente na apresentação de antigénios lipídicos mediada pelas moléculas CD1 e na infeção. A capacidade de apresentação de antigénios lipídicos mediada pelas moléculas CD1 foi avaliada em monócitos e em células dendríticas derivadas de monócitos de pacientes com doenças de sobrecarga lisossomal. Na doença de Fabry, Gaucher, NPC e MPS VI, as células dendríticas derivadas de monócitos não apresentam defeitos na capacidade de apresentação de antigénios lipídicos mediada pelas moléculas CD1b e CD1d e não foram encontradas alterações na frequência das células iNKT, ao contrário do que foi reportado em vários modelos de doenças de sobrecarga lisossomal em ratinhos. Além disso, na doença de Fabry e Gaucher, a capacidade de apresentação de antigénios lipídicos mediada pela molécula CD1d dos monócitos não diminuiu. Para além disso, foi investigado o impacto de diferentes condições de colheita de sangue na capacidade de apresentação de antigénios lipídicos mediada pela molécula CD1d dos monócitos. Monócitos isolados 24 horas após a colheita de sangue em ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA) apresentaram capacidade reduzida para ativar as células iNKT, quando comparados com os monócitos isolados 24 horas após a colheita de sangue em citrato. Este resultado é bastante relevante no contexto da apresentação de antigénios lipídicos mediada pela molécula CD1d e destaca a importância do anticoagulante escolhido para realizar ensaios funcionais com monócitos. Os macrófagos encontram-se severamente afetados em pacientes com doença de Gaucher e a capacidade dos macrófagos humanos com doença de Gaucher para combater infeções bacterianas está comprometida. Nesta tese, foi avaliada a capacidade dos macrófagos da doença de Gaucher em fagocitar e eliminar os parasitas Leishmania. Foi utilizado um modelo in vitro através do tratamento de macrófagos derivados da medula óssea de ratinhos com um inibidor da enzima β-glucocerebrosidase (epóxido de conduritol B), mimetizando a doença de Gaucher. Estes macrófagos foram capazes de internalizar e eliminar os parasitas, da mesma forma que as células controlo. Estes resultados contribuem para aumentar o conhecimento das doenças de sobrecarga lisossomal e da apresentação de antigénios lipídicos mediada pelas moléculas CD1.