Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/30451
Title: Adsorption of L-Asparaginase on silica-based supported ionic liquids
Other Titles: Adsorção da L-Asparaginase em líquidos iónicos suportados em sílica
Author: Bento, Rui Miguel Farinha
Advisor: Tavares, Ana Paula Mora
Neves, Márcia Carvalho
Keywords: L-asparaginase
Silica-based supported ionic liquids
Enzyme immobilization
Adsorption
Defense Date: 9-Dec-2020
Abstract: L-Asparaginase (L-ASNase) is a versatile enzyme that has important applications, mainly in the pharmaceutical industry, where it is used as an anti-leukemic biopharmaceutical, which requires a high degree of purity. Currently, this enzyme is conventionally purified through ion exchange chromatography, a very expensive technique, which makes the final product more expensive and makes its use on a large scale unviable. The investigation of new low-cost purification methods, less harmful to the environment and reliable when adapted on a large scale, is a constant. The main objective of this dissertation is to develop an alternative L-ASNase adsorption platform using silica based supported ionic liquids, with a view to purifying the enzyme, and consequently reduce its final price. This work consisted of the synthesis and characterization of silica based supported ionic liquids, namely, [Si][N3114]Cl, [Si][N3116]Cl, [Si][N3118]Cl, [Si][N3222]Cl, [Si][N3444]Cl, [Si][N3666]Cl e [Si][N3888]Cl, and subsequent application of these materials in the adsorption of commercial L-ASNase. In order to optimize the experimental procedure of the enzyme immobilization, studies on the effect of L-ASNase concentration, pH and contact time between the enzyme and the materials were carried out. The Freundlich and Langmuir models were applied to the experimental data to evaluate the type of adsorption of L-ASNase at the materials. In addition, the thermal stability of the enzyme and its reuse were studied. Finally, L-ASNase adsorption tests of Bacillus subtilis from a cell extract were performed, analysing the purity of the final extract by specific activity, SDS-PAGE and HPLC. The characterization of the supported ionic liquids denoted a successful synthesis. In the enzyme adsorption study the isotherm model that presented a better fit to the experimental data was the Langmuir model. It was concluded that for the adsorption of L-ASNase the material that presents the best results is [Si] [N3222] Cl, reaching a qmáx of 2.41 U.mg-1. For all materials it was possible to observe an increase in enzyme activity of up to 260% compared to activated silica (control), and a high recyclability. Using the L-ASNase from the cell extract, a 33% increase in the specific activity of the enzyme was recorded after its immobilization in [Si][N3222] Cl. This increase in purity after the adsorption of the extract was confirmed by the results of the SDS-PAGE. This work presents a promising and simple technique for immobilizing L-ASNase and, consequently, for its subsequent purification.
A L-Asparaginase (L-ASNase) é uma enzima versátil que possui uma ampla gama de aplicações importantes, principalmente na indústria farmacêutica, onde é utilizada como um biofármaco anti leucémico, o que exige um elevado grau de pureza. Atualmente, a purificação da L-ASNase é convencionalmente alcançada utilizando cromatografia de troca iónica, uma técnica muito dispendiosa, o que encarece o produto final e torna inviável a sua utilização em grande escala. A procura de novos métodos para a sua purificação com um custo económico baixo, menos prejudicial ao ambiente e possíveis de aplicar a uma grande escala, é uma constante. Esta dissertação tem como principal objetivo desenvolver uma plataforma alternativa de adsorção da L-ASNase utilizando líquidos iónicos suportados em sílica, com vista à purificação da enzima, e consequentemente diminuir o seu preço final. Este trabalho consistiu na síntese e caracterização de líquidos iónicos suportados em de sílica, nomeadamente, [Si][N3114]Cl, [Si][N3116]Cl, [Si][N3118]Cl, [Si][N3222]Cl, [Si][N3444]Cl, [Si][N3666]Cl e [Si][N3888]Cl, e posterior aplicação destes materiais na adsorção da L-ASNase comercial. De forma a otimizar o procedimento experimental da imobilização da enzima foram realizados estudos sobre o efeito da concentração de L-ASNase, do pH e do tempo de contacto entre a enzima e os materiais. Os modelos de isotérmicas de equilíbrio de adsorção de Freundlich e de Langmuir foram aplicados aos dados experimentais para avaliar o tipo de adsorção da L-ASNase nos materiais. Além disto, estudou-se a estabilidade térmica da enzima e a sua reutilização. Por fim, foram realizados testes de adsorção da L-ASNase de um extrato celular de Bacillus subtilis, analisando a pureza do extrato final por atividade específica, SDS-PAGE e HPLC. A caracterização dos líquidos iónicos suportados demonstrou que a sua síntese ocorreu com sucesso. No estudo de adsorção da enzima o modelo isotérmico que apresentou um melhor ajuste aos dados experimentais foi o modelo de Langmuir. Concluiu-se que para a adsorção da L-ASNase o material que apresenta melhores resultados é o [Si][N3222]Cl, atingindo um qmáx de 2.41 U.mg-1. Para todos os materiais foi possível observar um aumento da atividade da enzima até cerca de 260% em comparação com a sílica ativada (controlo), e uma elevada reciclabilidade. Utilizando a L-ASNase do extrato celular, foi registado um aumento da atividade específica da enzima de 33% após a sua imobilização no [Si][N3222]Cl. Este aumento da pureza após a adsorção do extrato foi confirmado pelos resultados do SDS-PAGE. Este trabalho apresenta uma técnica promissora e simples de imobilização da L-ASNase e, consequentemente, de posterior purificação da mesma.
URI: http://hdl.handle.net/10773/30451
Appears in Collections:UA - Dissertações de mestrado
DQ - Dissertações de mestrado

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