Effects of trace elements and UV filters on Ficopomatus enigmaticus: larval development and biochemical responses

Abstract

Previous studies suggested the suitability of the brackish-water serpulid Ficopomatus enigmaticus to be used as a model organism for both marine and brackish waters monitoring, by the performance of sperm toxicity and larval development assays. In this thesis, the impact of trace elements exposure (copper, mercury, arsenic, cadmium, and lead), at different concentrations, was studied on the larval development of two different populations of F. enigmaticus (Mediterranean Sea and Atlantic Ocean, collected in Italy and Portugal, respectively). Firstly, a molecular analysis based on Cyt b amplification and sequencing was carried out and confirmed that both populations belonged to the same species, allowing to validate the comparison of embryotoxicity results. The effect, measured in terms of EC50, showed that mercury was the most toxic metal for larvae of both populations. The tested trace elements may be racked in the following order from the highest to the lowest toxicity: Mediterranean population: mercury > copper > lead > arsenic > cadmium; Atlantic: mercury > copper > cadmium > arsenic > lead. Responses of both populations were similar for arsenic. The lead was the least toxic element for the Atlantic population, while cadmium showed the least toxicity for the Mediterranean population. Chemical analyses on soft tissues and calcareous tubes of collected test organisms and their sampling site water showed that populations exhibited less sensitivity to a certain element, together with a relevantly higher concentration of the same element in soft tissues. These results may indicate a certain resistance to particular contaminant toxic effects by organisms that tend to accumulate that same toxicant. Moreover, these results also highlight the potential correlation between wild-caught test organisms’ responses and deep characterization of the sampling site to identify putative abnormalities or differences in model organism response during bioassay execution. Another task of this thesis tackled UV filters as Contaminants of Emerging concern and aimed to assess the toxicity of a set of seven UV filters (Zinc oxide (ZnO) and Titanium dioxide (inorganics), Benzophenone-3, Avobenzone, Octocrylene, Ethylhexyl methoxycinnamate (EHMC) and 4-methylbenzylidene camphor (organics)) on three species: bioluminescence inhibition in Vibrio fischeri, growth inhibition of Phaeodactylum tricornutum, and on the correct larval development of F. enigmaticus. Results showed titanium dioxide to be the most toxic compound for P. tricornutum (EC50 of 0.04368 mg/L), while it did not induce toxicity for V. fischeri or F. enigmaticus. Ethylhexyl methoxycinnamate was very toxic to V. fischeri and the second most toxic to P. tricornutum. For F. enigmaticus, the lowest percentages of correct development were observed when exposed to 4-methylbenzylidene camphor, with an EC50 of 0.836 mg/L, followed by Zinc oxide (1.088 mg/L). Overall, Avobenzone has induced low toxicity, and Octocrylene was the least toxic for F. enigmaticus larvae. Regarding the larval development assay under different light and temperature conditions, higher percentages of correct development were obtained at 25 °C, independently of the incubation treatment. According to preliminary toxicity assessment, ZnO was more toxic than EHMC. This study becomes a relevant contribution to provide ecotoxicological data on the potential toxicity of UV filters (concerning both effects and behaviour under environmental factors), presenting data generated by organisms belonging to three trophic levels, being differently affected by UV filters exposure. The last task of this dissertation, concerns a biochemical parameters study after chronic exposure of adults of F. enigmaticus to ZnO and EHMC. It was observed that EHMC induced the highest levels of lipid peroxidation at 0.5 mg/L, pointing out the ability of this compound to, at high concentrations, produce considerable oxidative damage. Biotransformation capacity (assessed by the activity of glutathione S transferases), showed that both ZnO and EHMC have displayed a concentration dependent response. Both UV filters have significantly decreased the levels of acetylcholinesterase activity, such meaning a huge neurotoxic effect. The results obtained in this dissertation further help to reassure the sensitivity and suitability of the serpulid F. enigmaticus to be used as a model organism in ecotoxicological and ecological risk assessment assays.

Estudos anteriores sugeriram o serpulídeo de água salobra Ficopomatus enigmaticus como um bom organismo modelo para monitorização de águas costeiras e estuarinas, através da execução de testes de toxicidade em células espermáticas e no desenvolvimento larvar. Nesta tese, o impacto da exposição a elementos vestigiais (cobre, mercúrio, arsénio, cádmio e chumbo), a diferentes concentrações, foi estudado no desenvolvimento larvar de duas populações de F. enigmaticus (Mar Mediterrâneo e Oceano Atlântico, amostrados em Itália e Portugal, respectivamente). Inicialmente, uma análise molecular baseada na amplificação e sequenciação do gene Cyt b foi feita para confirmar que as duas populações pertenciam à mesma espécie, permitindo validar a comparação dos resultados de embriotoxicidade. O efeito, medido em termos de EC50, mostrou que o mercúrio foi o metal mais tóxico para as larvas das duas populações. Os elementos vestigiais testados mostraram a seguinte ordem, da toxicidade mais elevada para a mais baixa: população Mediterrânica: mercúrio > cobre > chumbo > arsénio > cádmio; Atlântica: mercúrio > cobre > cádmio > arsénio > chumbo. Respostas das duas populações foram semelhantes para o arsénio. O chumbo foi o menos tóxico para a população Atlântica, enquanto que o cádmio foi o menos tóxico para a população Mediterrânica. Análises químicas no tecido e tubos calcários dos organismos e água recolhida nos locais de amostragem mostraram que as populações exibiram menor sensibilidade a um certo elemento, em conjunto com concentrações mais altas desse mesmo elemento nos tecidos. Estes resultados podem indicar resistência a efeitos tóxicos de um contaminante em particular, por organismos que tendem a acumular esse mesmo elemento. Estes resultados também sublinham a potencial correlação entre a resposta de organismos teste selvagens e a caracterização dos locais de amostragem para identificar possíveis erros ou diferenças na resposta de organismos modelo, durante a execução do ensaio. Outro dos trabalhos desta tese tratou de filtros UV como ‘Contaminants of Emerging Concern’ e teve como objectivo avaliar a toxicidade de 7 filtros UV: (Óxido de Zinco (ZnO) e Dióxido de Titânio (inorgânicos), Benzofenona-3, Avobenzona, Octocrileno, Etilhexil metoxicinamato (EHMC) e 4-metilbenzilideno canfôra (orgânicos)) em três espécies: inibição da bioluminescência em Vibrio fischeri, inibição do crescimento em Phaeodactylum tricornutum, e no correcto desenvolvimento larvar de F. enigmaticus. Os resultados mostraram o dióxido de titânio como sendo o composto mais tóxico para P. tricornutum (EC50 de 0.04368 mg/L), enquanto que não induziu toxicidade para V. fischeri ou F. enigmaticus. O Etilhexil metoxicinamato mostrou-se muito tóxico para V. fischeri e o segundo mais tóxico para P. tricornutum. Para F. enigmaticus, as percentagens de desenvolvimento correcto mais baixas foram observadas para o 4-metilbenzilideno cânfora, com um EC50 de 0.836 mg/L, seguido pelo óxido de zinco (1.088 mg/L). No geral, a avobenzona induziu pouca toxicidade e o octocrileno foi o composto menos tóxico para as larvas de F. enigmaticus. Sobre o ensaio de desenvolvimento larvar em diferentes condições de luz e temperatura, as percentagens de desenvolvimento correcto mais altas foram obtidas a 25 °C, independentemente do tratamento de incubação. De acordo com a avaliação preliminar de toxicidade, o ZnO foi mais tóxico que o EHMC. Este estudo torna-se uma contribuição importante para fornecer dados ecotoxicológicos sobre a potencial toxicidade de filtros UV (tanto em relação a efeitos como ao comportamento sob factores ambientais), apresentando resultados gerados por espécies de três níveis tróficos, afectadas diversamente pela exposição a filtros UV. A última tarefa desta dissertação refere-se ao estudo de parâmetros bioquímicos após a exposição crónica de adultos de F. enigmaticus a ZnO e EHMC. Foi observado que o EHMC induziu os níveis mais altos de peroxidação lipídica, a 0.5 mg/L, indicando a capacidade deste composto para, a concentrações elevadas, induzir dano oxidativo. A capacidade de biotransformação (avaliada através da actividade das enzimas glutationa S transferases), mostrou que tanto o ZnO como o EHMC produziram uma resposta dependente da concentração. Ambos os filtros UV diminuíram significativamente os níveis de atctividade da acetilcolinesterase, o que aponta um efeito neurotóxico importante. Os resultados obtidos nesta dissertação ajudam a reafirmar a sensibilidade e adequabilidade do serpulídeo F. enigmaticus para uso como organismo modelo em ensaios ecotoxicológicos e avaliações de risco ecológico.