Evaluation of high-pressure as a novel non-thermal extraction technology to obtain extracts with improved biological activities

Abstract

Both stinging nettle and winter savory are both perennial herbs usually found in the Mediterranean area, being traditionally used as medicinal herbs against several ailments due to the biological properties associated to their rich chemical composition. The first part of the present work aimed to evaluate the effect of high pressure assisted extraction (HPE) and its optimization by response surface methodology using a central composite face centered design in order to obtain extracts with high content of bioactive compounds and improved bioactivities. The effect of pressure level, extraction time, and solvent (ethanol:water) concentration was evaluated, as also the impact of HPE on total phenolics (TPC), flavonoids, pigments, and antioxidant activity. Results showed that experimental data could be well fitted to second-order polynomial mathematical models. For stinging nettle leaves extraction process, the optimal conditions for maximization of extraction yield, TPC, and antioxidant activity were 200 MPa, 10.2-15.6 min, and 0% ethanol (aqueous extracts); while for winter savory leaves, the models predicted optimal conditions ranging from 200-500 MPa, extraction time 1-20 min, and ethanol concentration 0-70%. In comparison with control extraction at atmospheric pressure, HPE allowed to increase the extraction yield about 50.5%; TPC about 84.4%; and antioxidant activity about 77.7% for stinging nettle extracts; and an increase of about 40% for all compounds, 29, 48, and 70% for antioxidant activity by FRAP, DPPH and ABTS assays, respectively, for winter savory extracts. In the second part of this work, the biological properties and toxicity of the controls and the optimized extracts from both herbs were studied. The studied extracts were obtained at pressure levels ranging from 200 and 500 MPa, 10-20 minutes, 0-70% ethanol. Each extract was characterized for their individual compounds profile and different biological properties, such as antioxidant activity, pro-oxidant activity (DNA degradation capacity), as also its antimicrobial, antibiofilm, and antihypertensive activities. The extracts cytotoxicity and antiproliferative effect on human tumour cell lines were also evaluated. For stinging nettle, the extracts obtained at 200 MPa, 10 min, 35 and 70% ethanol were the ones presenting higher concentrations of TPC and flavonoids, such as chlorogenic acid, isoferulic acid, and rutin, being also the ones with better results concerning all the studied biological activities; while for winter savory, the extract obtained at 348 MPa, 20 min, 35% ethanol showed to be the most interesting, since it presented a high concentration of individual phenolic compounds, such as tuberonic acid glucoside, rosmarinic acid, salvianolic acid A. HPE extracts showed potential antioxidant and DNA protective activities, since they were able not only to cause fewer damages in the DNA molecule than the controls, but also were able to protect it against the damage caused by oxidative stress. Concerning the cytotoxicity, it was observed that HPE extracts, in a concentration of 0.5 and 1.0 mg/mL, were not harmful to HT29 cell lines, but the control extracts at higher concentration (>1.0 mg/mL) showed that the extracts can slightly reduce the metabolic activity. Finally, all the extracts showed to inhibit the viability of three cancerous cell lines (>2.0 mg/mL for Caco-2, HeLa, and TR146), indicating that these extracts may present a potential antitumoral activity. The last part of this work aimed to evaluate the effect of supplementation of carrot juice with winter savory leaves extract, on the final juice characteristics, after storage for 15 days under refrigeration. Supplemented juices presented lower microbial counts than the non-supplemented ones, and, generally, did not present significant changes (p>0.05) in pH or colour. Concerning the total phenolics and total flavonoids, as well as antioxidant activity, the values were generally higher in supplemented juices, which was proven by the high correlation found between total phenolics content and antioxidant activity by ABTS and FRAP assays.

Tanto a urtiga como a segurelha são ervas perenes geralmente encontradas na região do Mediterrâneo, sendo tradicionalmente usadas como ervas medicinais devido às propriedades biológicas associadas à sua composição química. A primeira parte deste trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da extração assistida por alta pressão (EAP) e sua otimização pela metodologia de superfície de resposta, utilizando um planeamento de composto central de face centrada, de modo a obter extratos com elevado conteúdo em compostos bioativos. Foram avaliados: o efeito do nível de pressão, o tempo de extração e a concentração de solvente (etanol:água), bem como o impacto da EAP sobre a concentração de fenólicos totais (FT), flavonóides, pigmentos e atividade antioxidante. Os resultados demonstraram que os dados experimentais poderiam ser bem ajustados a modelos matemáticos de segunda ordem. Para o processo de extração usando folhas de urtiga, as condições ideais para maximização do rendimento, FT e atividade antioxidante foram 200 MPa, 10,2-15,6 min e 0% etanol (extratos aquosos); enquanto que para as folhas de segurelha, os modelos previram condições ideais de extração que variam entre 200 e 500 MPa, tempo de extração de 1-20 minutos e concentração de etanol de 0-70%. Em comparação com a extração à pressão atmosférica, EAP permitiu aumentar o rendimento em cerca de 50,5%; FT cerca de 84,4%; e atividade antioxidante em cerca de 77,7% para extratos de urtiga; e um aumento de cerca de 40% para todos os compostos, 29, 48 e 70% para atividade antioxidante pelos ensaios FRAP, DPPH e ABTS, respetivamente, para os extratos de segurelha. Na segunda parte deste trabalho, foram estudadas as propriedades biológicas e a toxicidade dos extratos otimizados. Cada extrato foi caracterizado no que concerne ao seu perfil de compostos fenólicos individuais e diferentes propriedades biológicas, como atividade antioxidante, atividade pró-oxidante (capacidade de degradação de DNA), e também atividade antimicrobiana, anti-biofilme e atividade anti-hipertensiva. A citotoxicidade dos extratos e seu efeito anti-proliferativo em linhas celulares tumorais humanas também foram avaliados. Para a urtiga, os extratos obtidos a 200 MPa, 10 min, 35 e 70% de etanol foram os que apresentaram maiores concentrações de ácidos fenólicos e flavonóides, tais como o ácido clorogénico, ácido isoferúlico e rutina; sendo também os que apresentam melhores resultados em todas as atividades biológicas estudadas; enquanto que para a segurelha, o extrato obtido a 348 MPa, 20 min, 35% de etanol, mostrou-se o mais interessante, pois apresentou uma elevada concentração de compostos fenólicos individuais, como o ácido rosmarínico e ácido salvianólico A. Os extratos obtidos por EAP apresentaram potencial como antioxidantes e protetores de DNA, uma vez que foram capazes, não apenas de causar menores danos na molécula de DNA do que os controlos, como também foram capazes de a proteger contra danos causados devido ao stress oxidativo. Em relação à citotoxicidade, observou-se que os extratos de EAP, numa concentração de 0,5 e 1,0 mg/mL (para segurelha e urtiga, respectivamente), não foram prejudiciais ao metabolismo da linhagem celular HT29; enquanto que os controlos em concentrações superiores (>1.0 mg/mL) causaram uma ligeira redução da atividade metabólica. Por fim, todos os extratos causaram uma inibição da viabilidade de três linhagens celulares cancerígenas (>2.0 mg/mL para Caco-2, HeLa, e TR146), indicando que estes extratos poderão apresentar uma potencial atividade anti-tumoral. A última parte deste trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da suplementação de sumo de cenoura com extrato de segurelha nas características finais do sumo, após armazenamento durante 15 dias em refrigeração. Os sumos suplementados apresentaram contagens microbianas mais baixas do que os não suplementados e, geralmente, não apresentaram alterações significativas (p>0,05) no pH nem na cor. Em relação aos fenólicos totais e flavonóides, bem como relativamente à atividade antioxidante, os valores foram geralmente mais altos para os sumos suplementados, o que foi comprovado pela elevada correlação encontrada entre a concentração de fenólicos totais e a atividade antioxidante determinada pelos métodos de ABTS e FRAP.