Campylobacter: Impacte na saúde humana e segurança alimentar

Abstract

Campylobacter é a causa mais frequente de gastroenterite bacteriana na Europa. Ao contrário de outras doenças zoonóticas, a incidência europeia de infeções por Campylobacter aumentou na última década. Das diversas espécies de Campylobacter são as termófilas as mais frequentemente associadas a infeção humana, nomeadamente Campylobacter jejuni, responsável por cerca de 80% a 90% dos casos de campilobacteriose, seguida por Campylobacter coli. A maneira mais frequente de um indivíduo se infetar com Campylobacter é através do consumo de alimentos contaminados principalmente aves, sendo a carne de frango apontada como a principal fonte de campilobacteriose. A deteção de Campylobacter em alimentos e animais é geralmente baseada em cultura. Métodos moleculares, Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS), são usados para identificação das espécies. O presente projeto teve quatro objetivos. O primeiro consistiu em validar uma metodologia para detetar, em amostras de carne de frango e em esfregaços de superfícies de embalagens que acondicionavam carne de frango, a presença de C. jejuni e C. coli no meio de enriquecimento, por uma reação em cadeia da polimerase (Screening-PCR) baseada na amplificação do gene mapA de C. jejuni e do gene ceuE de C. coli. As amostras, após submetidas a um enriquecimento, foram isoladas em meios seletivos para deteção e posterior caracterização do microrganismo alvo, segundo a ISO 10272-1:2017. O segundo objetivo consistiu em validar a metodologia Screening-PCR em pools de amostras de carne de frango e em pools de esfregaços de superfícies de embalagens. Pretendeu-se ainda à monitorização da presença de Campylobacter em carne de frago no retalho e na superfície exterior das embalagens onde a carne de frango se encontrava acondicionada. A monitorização de embalagens é importante para avaliar o risco de contaminação pelo contacto com as mãos e superfícies entre as quais as de géneros alimentícios. As amostras foram selecionadas por conveniência tendo sido recolhidas em supermercados e talhos na região norte de Portugal. Foram recolhidas amostras de carne de frango (n=60) e superfícies de embalagens contendo carne de frango (n=63). A metodologia de Screening-PCR do meio de enriquecimento não detetou falsos negativos, tendo o resultado sido concordante com a deteção de Campylobacter de acordo com a ISO 10272-1:2017 em 96% das amostras ensaiadas. Em 4% das amostras foi detetada a presença de genes para C. jejuni e/ou C. coli por PCR no caldo de enriquecimento, mas não foi possível isolar essas estirpes. A metodologia de PCR evidenciou a dificuldade do isolamento de mais de uma espécie na mesma amostra. A monitorização da presença de Campylobacter em 10 gramas de carne de frango e em embalagens de carne de frango colocadas no retalho permitiu detetar a presença respetivamente em 58% e 27% das amostras ensaiadas. Foi detetada a presença de C. jejuni em 88% e C. coli em 25% das amostras positivas para Campylobacter spp. Nas amostras positivas no Screening-PCR para ambas as espécies, não foi possível isolar as duas espécies em 81% das amostras. Estes números mostram a importância de consciencializar a população dos cuidados necessários de higiene na manipulação de carne de frango, na separação dos géneros alimentícios crus e das respetivas embalagens de alimentos que se encontram prontos para sere consumidos, bem como dos que não vão ter um processo térmico e das superfícies utilizadas no seu processamento. A presente dissertação apresenta uma metodologia que rapidamente diferencia os casos negativos dos prováveis positivos, sendo só nestes, necessário prosseguir o ensaio para confirmação da presença de Campylobacter spp. por isolamento de estirpes. A utilização de pools de amostras foi validada o que permitiu diminuir gastos e aumentar número de amostras a ser testadas por reação, em futuros estudos de monitorização. Ficámos cientes que a identificação de espécies de Campylobacter presentes nas amostras terá de ser realizada num maior número de colónias isoladas do que as 5 estabelecidas para a deteção do género Campylobacter. As estirpes isoladas neste estudo poderão ser utilizadas em estudos de avaliação de resistência de Campylobacter a antimicrobianos, pesquisar fatores de virulência, comparar com estirpes isoladas em humanos, animais e no ambiente, entre outros estudos que irão ajudar ao conhecimento da epidemiologia da campilobacteriose e facilitar a gestão do risco.

Campylobacter is the most common cause of bacterial gastroenteritis in Europe. Unlike other zoonotic diseases, the number of infections by Campylobacter has increased in the last decade. Of the various species of Campylobacter, thermophilic Campylobacter are those which are most commonly associated with human infection, specifically Campylobacter jejuni which accounts for approximately 80%-90% of campylobacteriosis cases followed by Campylobacter coli. Infection by Campylobacter is most frequently spread through the consumption of contaminated foods, particularly poultry. Chicken meat has been considered the main source of contamination by Campylobacter. The most used and trusted method of detection of Campylobacter in food and animals is by culture. Molecular methods Polymerase Chain Reaction (PCR) and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF-MS) are used in the identification of species. There were four aims to this project; firstly, the validation of a screening method used to detect the presence of C. jejuni and C. coli in both poultry samples and swabs of the outer packaging of poultry in an enrichment medium by screening for polymerase chain reaction (PCR) based on the amplification of the mapA gene in C. jejuni and the ceuE gene in C. coli. After being enriched samples were isolated in selective mediums for the detection and later characterization of the targeted microorganism according to ISO 10272-1:2017. The second aim of this project was the implementation and validation of the screening-PCR method by pooling chicken and packaging swab samples. It was also intended to monitor the presence of Campylobacter in commercially sold chicken, and on the outer packaging of poultry. Testing packaging is crucial in assessing the risk of contamination through contact with our hands and contact with other surfaces, namely food surfaces. Samples were selected based on convenience and were take from both supermarkets and butchers in the northern region of Portugal. Poultry (n=60) and poultry packaging (n=63) samples were used. The conventional combined PCR and enrichment-based screening method did not detect any false negatives and the results were in line with ISO 10272-1:2017 in the detection of the Campylobacter species in 96% of the test samples. The presence of Campylobacter genes was detected in 4% of the samples by using the Screening-PCR, however it was not possible to isolate these strains. The PCR method proved inefficient in isolating more than one species in the same sample. The monitorization of the presence of Campylobacter in 10 grams of commercially sold chicken and packaging enable detection of a respective 58% presence and 27% presence in the test samples. C. jejuni was detected in 88% and C. coli was detected in 25% of the samples which testes positive for Campylobacter spp. In the positive samples in Screening-PCR for both species, it was not possible to isolate the two species in 81% of the samples. These figures emphasize the need to raise the public’s awareness as to proper hygiene practices when handling poultry and surfaces used when processing chicken as well as the need to correctly separate raw foodstuffs and respective packaging from ready-to-eat foods and foods that do not require thermal processing. The present thesis presents a methodology that quickly differentiates the negative from the probable positive cases, being only in these, it is necessary to continue the test to confirm the presence of Campylobacter spp. Isolation of strains. The use of sample pools has been validated, which allows reducing costs and increasing sampling in future monitoring studies. We were aware that the identification of Campylobacter species present in the samples will have to be carried out in a greater number of isolated colonies. The strains isolated in this study can be used in studies to evaluate Campylobacter resistance it antimicrobials, evaluate virulence factors, compare with strains isolated in humans, animals and the environment, among other studies that will help to understand the epidemiology of campilobacteriosis and facilitate risk management.