Molecular techniques and target selection for the identification of Candida species in complex biological samples

Abstract

Candida albicans is the most common causative agent of oral candidiasis, although other Candida species are often present in medically compromised patients. In oral candidiasis, yeast cells must adhere to the oral surface, otherwise are washed away by the salivary fluxes. One of the most important virulence factors of Candida species is their ability to adhere and form biofilms. Medical devices, such as denture, are a platform for the yeast to anchor and easily begin tissue colonization, leading to oral candidiasis. Denture stomatits is a debilitating oral disease that can reduce drastically the quality of life for some individuals. As different biofilms have distinct patterns of susceptibility, it is imperative to identify the species causing the infection to avoid a hit-or-miss treatment. Several molecular approaches have been developed for the accurate identification of Candida spp., Polymerase Chain Reaction (PCR), Microarray, High Resolution Melting Analysis (HRMA), Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP), Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF). These techniques make use of different selected targets, being the ITS1 and ITS2 regions of the rRNA gene cluster considered the gold standard. However, there is currently no consensus about which technique is better suited for application as a diagnostic tool in clinical settings. The present work intends to perform an extensive description of all the molecular techniques that are currently used in the diagnosis of Candida spp. in an oral context. This work provides an evaluation of these molecular techniques, balancing different criteria such as speed, cost, and precision, which depict an ideal diagnostical tool. To do this, several clinical studies that make use of complex biological samples were examined, with special focus on the molecular identification tools that are used. A comparative analysis of these molecular tools was performed, considering all features that need to be taken into account for an optimal diagnostic method. Based on comparative analysis of these techniques , LAMP and Multiplex PCR have proven to be the most suitable for use by healthcare workers as a point of care device. An additional in silico analysis was perform to test the specificity of Multiplex PCR and LAMP, testing already described primer sets for Multiplex PCR and newly designed LAMP primers. Hence, this work provides a comprehensive overview in the global knowledge of molecular strategies that can be applied in the diagnostic of Candida infections, shedding light of which techniques may be adapted in the future for clinical application.

Candida albicans é o agente causador mais comum da candidíase oral, embora outras espécies de Candida estejam frequentemente presentes em pacientes clinicamente comprometidos. Na candidíase oral, as células da levedura devem aderir às superfícies orais, caso contrário, são lavadas pelos fluxos salivares. Um dos fatores de virulência mais importantes das espécies de Candida é a capacidade de aderir e formar biofilmes, usando uma variedade de mecanismos. Dispositivios médicos, como próteses, são uma plataforma para o ancorar e facilmente iniciar a colonização do tecido, levando à candidíase oral. A estomatite protética é uma doença oral debilitante, provocada por esta adesão, que pode reduzir drasticamente a qualidade de vida de alguns indivíduos. Como diferentes biofilmes têm padrões distintos de suscetibilidade, é imperativo identificar as espécies que causam a infeção para evitar um tratamento de “hit-or-miss”. Várias abordagens moleculares foram desenvolvidas para a identificação de Candida spp., como Polymerase Chain Reaction (PCR), Microarray, High Resolution Melting Analysis (HRMA), Restriction Fragment Length Polymorfism (RFLP), Loop-mediated isothermal amplification (LAMP), Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight (MALDI-TOF), com diferentes alvos selecionados, sendo as regiões ITS1 e ITS2 do cluster que codifica os genes rRNA amplamente utilizadas. No entanto, atualmente não há uma decisão sobre a técnica mais adequada para a aplicação como uma ferramenta de diagnóstico em contextos clínicos. O presente documento pretende realizar uma descrição de todas as técnicas moleculares, atualmente utilizadas no diagnóstico de Candida spp., num contexto oral. O trabalho fornece uma avalição dessas técnicas moleculares, equilibrando diferentes critérios como velocidade, custo e precisão, que representam uma ferramenta diagnóstica ideal. Para isso, foram examinados vários estudos clínicos que utilizam amostras biológicas complexas, com foco especial nas ferramentas de identificação molecular utilizadas. Foi realizada uma análise comparativa dessas ferramentas moleculares, considerando todos os recursos que precisam ser levados em consideração para um método de diagnóstico ideal. Com base na análise comparativa dessas técnicas, LAMP e Multiplex PCR mostraram ser os mais adequados para o uso por profissionais de saúde. Uma análise in silico adicional foi realizada para testar a especificidade de Multiplex PCR e LAMP, testanto os conjuntos de primers já descritos para Multiplex PCR e novos primers para LAMP desenvolvidos neste estudo. Este trabalho fornece uma visão abrangente de estratégias moleculares que podem ser aplicadas no diagnóstico de infeções por Candida spp., esclarecendo quais as técnicas que têm potencial para serem adaptadas à clínica no futuro.