S. Coronopifolius Bromoterpenes : antitumor activity and intracellular signal pathways characterization on in vitro cancer models

Abstract

Nowadays, cancer is one of the major threats to human health and, due to distinct factors, it is expected that its incidence will increase in the next decades leading to an urgent need to develop new approaches to fight it, including the development of new anticancer drugs. Marine environment has revealed to harbor a vast diversity of unusual and distinct chemical structures with high potential to be used as scaffolds for the design and development of new drugs with great effectiveness and specificity to human illnesses, such as cancer. Therefore, the main goal of the present thesis was to study the chemical profile of the red alga Sphaerococcus coronopifolius collected in the Berlenga Nature Reserve (Peniche, Portugal) as well as to evaluate the antitumor activities of its major metabolites. The study of S. coronopifolius chemical profile allowed, through antitumor bioguied screening, to identify seven compounds, including five already known terpenes, alloaromadendrene (1), bromosphaerol (3), sphaerococcenol A (4),12S-hydroxy-bromosphaerol (5), and 12R-hydroxy-bromosphaerol (7), as well as two new natural molecules, a new brominated dactylomelane diterpene, named sphaerodactylomelol (2) and a new brominated 7-epi-eudesmane sesquiterpene, named 6-acetyl-sphaeroeudesmanol (6). Compounds (2-5, 7) exhibited antiproliferative activity on an in vitro model of human hepatocellular carcinoma (HepG2) in an IC50 range between 42.87 to 279.93 μM being the highest activity induced by sphaerococcenol A (4) (IC50: 42.87 μM). The new diterpene, sphaerodactylomelol (2), was the only compound that induced cytotoxicity (IC50: 719.85 μM) on HepG2 cells. Hence, due to the cytotoxic activities exhibited by the compounds 2-5 and 7 on HepG2 cells, their antitumor potential was evaluated on several in vitro human cancer cells derived from distinct tissues (SH-SY5Y; MCF-7; A549; NCI-H226; PC-3; HCT-15; CACO-2; SK-MEL-28; RenG2) to define their selectivity and potency (0.1 - 100 μM; 24 hours). Murine fibroblasts (3T3) were used as non-tumor cells. S. coronopifolius compounds did not displayed selective activity for specific tumor tissue as well as for cancer cells. Concerning the potency of the effects, S. coronopifolius metabolites exhibited an IC50 range between 4.47 to 89.41 μM. Sphaerococcenol A (4) showed the highest cytotoxicity exhibiting a range of IC50 between 4.47 to 16.59 μM and sphaerodactylomelol (2) displayed the lowest cytotoxicity showing a range of IC50 between 33.04 and 89.41 μM. In addition, to understand the intracellular signaling pathways linked to their cytotoxic activities, hallmarks associated to reactive oxygen species production, namely through hydrogen peroxide (H2O2) real-time production, and apoptosis (membrane translocation of phosphatidylserine, mitochondrial membrane potential, Caspase-9 activity, and DNA condensation and/ or fragmentation) were studied on an in vitro breast carcinoma model (MCF-7 cells). Genotoxic activities were evaluated on fibroblasts derived from mouse tissues (L929 cells). The treatment of MCF-7 cells with compounds induced changes in the mitochondrial membrane potential, increased Caspase-9 activity, and promoted DNA condensation and/or fragmentation. In addition, with the exception of bromosphaerol (3), all compounds promoted the increase of H2O2 levels production. Regarding genotoxic effects, only bromosphaerol (3) mediated DNA damage in L929 cells. Additionally, to evaluate the compounds' effects in a system similar to a tissue, co-cultures of non-malignant human bronchial fibroblasts and malignant human bronchial epithelial cells were implemented. 12R-hydroxy-bromosphaerol (7) revealed to be the compound with highest potential exhibiting cytotoxicity and ability to prevent the formation of malignant stem cells. Summarizing, Sphaerococcus coronopifolius bromoditerpenes exhibited cytotoxic activities, which seems to be linked to apoptosis, H2O2 generation and induction of DNA damage. Despite the interesting results achieved, this work is an initial approach being of utmost importance to deeply characterize the intracellular signaling pathways associated with antitumor activities mediated by these compounds in order to define their effective pharmacological potential in cancer therapeutics.

Atualmente, o cancro representa um dos maiores desafios para a saúde humana e, devido a diversos fatores, é expectável que a sua incidência aumente nas próximas décadas tornando-se de extrema importância desenvolver novas abordagens terapêuticas, incluindo o desenvolvimento de novos fármacos. Neste âmbito, o ambiente marinho tem revelado albergar uma elevada diversidade de estruturas químicas incomuns e distintas com potencial para serem usadas como “scaffolds” no design e desenvolvimento de novos fármacos com grande eficácia e especificidade para o tratamento de doenças humanas, como o cancro. Desta forma, o principal objetivo da presente tese consistiu em estudar o perfil químico da alga vermelha Sphaerococcus coronopifolius recolhida na Reserva Natural da Berlenga (Peniche, Portugal) assim como avaliar as atividades antitumorais dos seus principais metabolitos. O estudo do perfil químico da alga S. coronopifolius, através de screening bioguiado, permitiu identificar sete compostos, incluindo cinco terpenos previamente descritos e denominados como alloaromadendrene (1), bromosphaerol (3), sphaerococcenol A (4), 12S-hydroxy-bromosphaerol (5) e 12R-hydroxy-bromosphaerol (7), assim como duas novas moléculas de origem natural, nomeadamente um diterpeno dactilomelano bromado, designado sphaerodactylomelol (2), e um novo sesquiterpeno 7-epi-eudesmano bromado, designado 6-acetyl-sphaeroeudesmanol (6). Os compostos (2-5 e 7) exibiram atividade antiproliferativa num modelo in vitro de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) num intervalo de IC50 entre 42.87 e 279.93 μM, sendo a atividade mais potente induzida pelo sphaerococcenol A (4) (IC50: 42.87 μM). Por sua vez, o novo diterpeno, sphaerodactylomelol (2), foi o único composto que induziu citotoxicidade (IC50: 719.85 μM) nas células HepG2. Consequentemente, devido às atividades exibidas pelos compostos 2-5 e 7 nas células HepG2, o seu potencial antitumoral foi avaliado em diferentes modelos celulares in vitro de cancro humano derivados de diferentes tecidos (SH-SY5Y; MCF-7; A549; NCI-H226; PC-3; HCT-15; CACO-2; SK-MEL-28; RenG2) de modo a definir a sua seletividade e potência (0.1 - 100 μM; 24 h). Fibroblastos derivados de tecidos murinos (3T3) foram usados como modelo não tumoral. Os compostos não demonstraram seletividade nem para células tumorais nem entre os modelos derivados de diferentes tecidos. No que diz respeito à capacidade citotóxica, os compostos exibiram um intervalo de IC50 entre 4.47 e 89.41 μM. O sphaerococcenol A (4) induziu o maior efeito citotóxico exibindo um intervalo de IC50 entre 4.47 e 16.59 μM enquanto o sphaerodactylomelol (2) demonstrou ser o composto menos citotóxico exibindo um intervalo de IC50 entre 33.04 e 89.41 μM. De modo a compreender as vias de sinalização intracelular envolvidas nas atividades citotóxicas observadas, biomarcadores associados à produção de espécies reativas de oxigénio, nomeadamente a produção de peróxido de hidrogénio (H2O2) em tempo real, e apoptose (translocação da fosfatidilserina, potencial mitocondrial membranar, atividade da Caspase-9, condensação de ADN e/ ou fragmentação) foram estudados num modelo in vitro de carcinoma humano da mama (MCF-7). As atividades genotóxicas foram avaliadas em fibroblastos derivados de tecidos murinos (L929). O tratamento realizado nas células MCF-7 com os compostos isolados induziu alterações no potencial mitocondrial membranar, aumentou a atividade da Caspase-9 e promoveu a condensação e/ ou a fragmentação de ADN. Com a exceção do bromosphaerol (3), todos os compostos promoveram um aumento da produção dos níveis de H2O2. No que diz respeito aos ensaios de genotoxicidade, apenas o bromosphaerol (3) mediou danos no ADN das células L929. Tendo em vista avaliar os supracitados compostos num sistema que mais se aproximasse a um tecido foram implementadas co-culturas de fibroblastos bronquiais humanos não malignos e células do epitélio bronquial humano malignizadas tendo o 12R-hydroxy-bromosphaerol (7) induzido citotoxicidade e capacidade de impedir a formação de células estaminais malignas. Resumindo, os bromoterpenos isolados da alga vermelha Sphaerococcus coronopifolius exibiram atividades citotóxicas relevantes, as quais parecem estar associadas aos processos de apoptose, produção de H2O2 e danos de ADN. Por sua vez, o composto 12R-hydroxy-bromosphaerol (7) demonstrou ser o composto mais promissor nos ensaios realizados em sistema de co-cultura impedindo a formação de células tumorais com fenótipo estaminal. Apesar dos resultados obtidos, este trabalho consistiu numa abordagem inicial sendo de extrema importância caraterizar profundamente as vias de sinalização intracelular associadas às atividades antitumorais mediadas por estes compostos de modo a compreender o seu verdadeiro potencial como agentes farmacológicos na terapia do cancro.