Halocins and lanthipeptides from Haloferax mediterranei

Abstract

The study of archaea's secondary metabolites, including archaeocins, is still limited. These antimicrobial peptides are poorly studied, especially when compared to the numerous studies on antibiotic production by other microorganisms. Only two types of archaeocins are known: i) halocins, produced by halophilic archaea and ii) sulfolobicins, produced by the extremely thermophilic Sulfolobus spp. There are also promising reports of archaeocins endowed with anticancer properties. Halophilic archaea have recently been found to be present in the human gut, thus showing that they are not confined to high salt environments alone. Halocins were firstly discovered in the 80’s and most of their characterization was solely based on supernatant-based assays. In fact, only a few halocins were successfully purified and sequenced, and even fewer have a proposed biosynthetic mechanism. Also, their mode of action, ecological role and biotechnological potential are still little explored. H. mediterranei ATCC 33500 has antiarchaeal activity. Studies determined that these strains produced the HalH4 halocin. However, over the last years, it was shown that strains lacking the halH4 gene retained their antiarchaeal ability. So, the molecule(s) responsible for its microbial activity is still unknown. This strain encodes in its genome three class II lanthipeptide synthetases (MedM1, MedM2 and MedM3) and some putative lanthipeptide precursor peptides. A high percentage of the lanthipeptides produced by Bacteria has antimicrobial activity. This study aimed to summarize the information available so far on haloarcheocins (the halocins produced by Archaea) at two levels: bibliographical and by analysing the gene clusters known so far using comparative genomics. For the haloarcheocin, HalC8, it was possible to determine the putative biosynthetic clusters involved in the production of HalC8 and HalC8-related peptides by Haloarchaea, which includes a protein of unknown function (HalU), two membrane-located peptides (HalP1 and HalP2) and a transcriptional regulator (HalR). Other aim of this study was to determine if the lanthipeptides of H. mediterranei ATCC 33500 were haloarcheocins contributing to its antimicrobial profile. To achieve this, knock-out mutants without medM1, medM2 and medM3 genes were obtained by employing the pop-in and pop-out strategy. It was found that approximately 20 days and 6 months are required to obtain a single or a triple knock-out strains, respectively. The bioactivity of the triple knock-out (ΔM1M2M3) was tested against other halobacteria. However, no differences were observed in the halos produced by the ΔM1M2M3 strain and its parental strain (WR510). These results prove that the putative class II lanthipeptides of H. mediterranei are not involved in its antiarchaeal profile. Thus, their function in haloarchaea is still to be unravelled.

O estudo dos metabolitos secundários produzidos por Arquea, incluindo as arqueocinas, péptidos com atividade antimicrobiana, é ainda muito limitado, especialmente quando comparado com os estudos existentes relacionados com a produção destes compostos por outros microrganismos. Apenas dois tipos de arqueocinas são conhecidos: i) halocinas produzidas por arqueas halofílicas e ii) sulfolobicinas, produzidas por um extremófilo do género Sulfolobus spp.. Também foram reportadas, arqueocinas promissoras com possíveis caraterísticas anticancerígenas. Arquea halofílicas foram recentemente encontradas no intestino humano, mostrando que a sua presença não se restringe apenas a ambientes hipersalinos. A descoberta das halocinas é recente e grande parte da sua caracterização baseia-se em ensaios feitos com sobrenadantes de culturas. Apenas algumas halocinas foram purificadas e sequenciadas com sucesso, e só para um grupo mais restrito é que existe uma proposta de modelo biossintético. H. mediterranei ATCC 33500 tem atividade anti-arquea. Estudos determinaram que esta estirpe produz a halocina HalH4. No entanto, ao longo dos últimos anos, foi demonstrado que mesmo na ausência do gene halH4 esta estirpe manteve a sua capacidade anti-arquea. Assim, a(s) molécula(s) responsável(eis) por tal atividade ainda é desconhecida. H. mediterranei codifica no seu genoma três enzimas modificadoras de lantipéptidos de classe II (MedM1, MedM2 e MedM3) e alguns péptidos precursores. Uma elevada percentagem dos lantipéptidos produzidos por bactérias tem actividade antimicrobiana. Este estudo teve como objectivo resumir a informação disponível até agora sobre as haloarqueocinas (as halocinas produzidas por Archaea) a dois níveis: bibliográfico e através da análise dos clusters biossintéticos conhecidos até agora utilizando genómica comparativa. Para a haloarqueocina HalC8, foi possível determinar os possíveis genes biossintéticos envolvidos na sua produção. Estes genes codificam uma proteína de função desconhecida (halU), dois péptidos localizados na membrana (halP1 e halP2) e um regulador transcricional (halR). Outro objetivo foi determinar se os lantipéptidos de H. mediterranei ATCC 33500 eram haloarqueocinas. Para tal, mutantes knock-out sem os genes medM1, medM2 e medM3 foram obtidos utilizando a estratégia pop-in e pop-out. Verificou-se que são necessários aproximadamente 20 dias e 6 meses para obter uma única ou tripla estirpe knock-out, respetivamente. A bioatividade do knock-out triplo (ΔM1M2M3) foi testada contra outras haloarqueas. No entanto, não foram observadas diferenças nos halos produzidos pela estirpe ΔM1M2M3 e pela sua estirpe parental (WR510). Estes resultados provam que os supostos lantipéptidos de classe II de H. mediterranei não estão envolvidos no seu perfil anti-arquea. Assim, a sua função em haloarquea continua desconhecida.