Multifunctional nanomedicine for the intracellular delivery of an antibody to CD44v6 expressing cancer cells

Abstract

Colorectal cancer (CRC) is one of the most incident and mortal cancers in the world, mainly due to its metastatic ability. CD44 receptor isoform containing exon 6 (CD44v6) in colorectal cells have been implied in many cancers associated process including metastasis. CD44v6 is a co-receptor for hepatocyte growth factor (HGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF), along with c-Met and VEGF receptor 2 (VEGFR-2), respectively. Standard chemotherapy regimens recommend for metastatic stages of CRC are commonly associated with severe side effects because they act non-selectively. Therapies that act specifically against a molecular target enhance efficacy of the drugs, resulting in lower toxicity. One example is bevacizumab (Avastin®), an anti-angiogenic monoclonal antibody (mAb) that inhibits VEGF action. Drug delivery systems (DDS), as nanoparticles (NPs) can be conjugated with ligands in order to be directed to a specific molecular target. One type of ligand with high affinity to cell receptors are antibodies. In this work, it was developed an innovate nanosystem, with polymeric NPs of poly(lactic-co-glycolic acid)-polyethylene glycol (PLGA-PEG) loaded with bevacizumab and decorated with an antibody fragment (Fab) specific for CD44v6-expressing human cancer cells, the AbD15179 (v6 Fab). Bare and (-) Fab PLGA-PEG NPs were also developed to evaluate the specificity of v6 Fab. The NPs produced displayed sizes in the range of 200-300 nm and a negative surface electric charge between -5 and -10 mV, with an association efficiency (AE) of bevacizumab around 85%. Overall, the formulations at a concentration of 5 and 50 μg/mL did not show toxicity in cancer cells. The v6 Fab-PLGA-PEG NPs specifically bonded to the surface of cells overexpressing CD44v6 and this affinity was maintained with the encapsulation of bevacizumab. Also, PLGA-PEG NPs functionalized with v6 Fab were more internalized in cells than the bare and (-) Fab-PLGA-PEG NPs. To confirm the specificity of bevacizumab-loaded v6Fab-PLGA-PEG NPs, intracellular levels of bevacizumab and VEGF were evaluated after incubation of PLGA-PEG NPs. Intracellular levels of bevacizumab were significantly higher in cells incubated with v6 Fab-PLGA-PEG NPs. The percentage of intracellular VEGF levels did not show significance between the groups but was possible to observe a tendency in the decrease of VEGF levels after incubation with v6 Fab-PLGA-PEG NPs. In this work it was demonstrated that it is possible to encapsulate a mAb in PLGA-PEG NPs and then functionalize with a Fab for a specific and effective intracellular delivery of the drug. Though, their use in drug delivery requires further investigation and optimization.

O cancro colorretal (CCR) é um dos cancros mais incidentes e mortais no mundo, maioritariamente devido à sua capacidade de metastização. A isoforma do recetor CD44 com o exão 6 (CD44v6) nas células colorretais tem sido envolvida em diversos processos cancerígenos, incluindo metástases. O CD44v6 é coreceptor para o fator de crescimento de hepatócitos (HGF) e fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), junto com o c-Met e o recetor VEGF 2 (VEGFR-2), respetivamente. Os regimes padrão de quimioterapia recomendada para os estádios metastáticos do CCR estão frequentemente associados a efeitos secundários graves, uma vez que não atuam seletivamente. As terapias que atuam seletivamente contra um alvo molecular melhoram a eficácia dos fármacos, resultando em menor toxicidade. Um exemplo é o bevacizumab (Avastin®), um anticorpo monoclonal (mAb) que atua inibindo a ação do VEGF. Sistemas de entrega de fármacos (DDS), como nanopartículas (NPs), podem ser conjugados com ligandos de modo a serem direcionados para um alvo molecular específico. Um tipo de ligando com elevada afinidade para recetores celulares são os anticorpos. Neste trabalho foi desenvolvido um nanosistema inovador, com NPs poliméricas de poli(ácido láctico-co-glicólico)-polietilenoglicol (PLGA-PEG) encapsuladas com bevacizumab e conjugadas com um fragmento de anticorpo (Fab) específico para células cancerígenas humanas com expressão de CD44v6, o AbD15179 (Fab v6). Foram também produzidas NPs não funcionalizadas e com um Fab (-) para avaliar a especificidade do Fab v6. As NPs produzidas apresentaram um tamanho entre 200 a 300 nm e uma carga elétrica superficial negativa entre -5 e -10 mV, com uma eficiência de associação (EA) do bevacizumab de cerca de 85%. No geral, as formulações com uma concentração de 5 e 50 μg/mL não demonstraram toxicidade em células cancerígenas. As NPs de PLGA-PEG Fab v6 ligaram-se especificamente à superfície das células que sobreexpressam o CD44v6 e essa afinidade foi mantida com a encapsulação de bevacizumab. Além disso, as NPs PLGA-PEG Fab v6 mostraram maior internalização celular do que as NPs não funcionalizadas e Fab (-). De modo a confirmar a especificidade das NPs PLGA-PEG Fab v6 com bevacizumab, os níveis intracelulares de bevacizumab e VEGF foram avaliados. Os níveis intracelulares de bevacizumab foram significativamente mais elevados nas células incubadas com NPs PLGA-PEG Fab v6. Os níveis intracelulares de VEGF não mostraram significância entre os grupos, mas foi possível observar uma tendência na diminuição dos níveis de VEGF após a incubação das NPs PLGA-PEG Fab v6. Neste trabalho foi demonstrado que é possível encapsular um mAb em NPs PLGA-PEG e funcionalizar com um Fab para uma entrega intracelular do fármaco específica efetiva. No entanto, o seu uso na entrega de fármacos requer mais investigação e otimização.