Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/28314
Title: Unravelling Lasiodiplodia theobromae and Lasiodiplodia hormozganensis virulence via functional genomics and metabolites isolation
Other Titles: Estudo da virulência de Lasiodiplodia theobromae e Lasiodiplodia hormozganensis por genómica funcional e isolamento de metabolitos
Author: Ferreira, Vanessa Agostinho
Advisor: Alves, Artur
Fischer, Jochen
Keywords: Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
Fermentation
Opportunistic fungi
Human infections
Secondary metabolites
Defense Date: Dec-2019
Abstract: Global climate change may lead to interactions of pathogenic fungi with new hosts, even from different kingdoms. In order for this to occur, fungi need to develop specific virulence mechanisms for the new host, for example through production of virulence factors. Some phytopathogenic fungi belonging to Botryosphaeriaceae are known human opportunistic pathogens. Moreover, the genus Lasiodiplodia has been reported in several human infections. Nonetheless, the virulence mechanisms behind this ability are still in need of research. The goal of this thesis consisted on the study of virulence towards human hosts by L. theobromae - strain LA-SOL3 - (isolate from grapevine) and L. hormozganensis - strain CBS339.90 - (isolated from human patient). In chapter 1, gene targeted replacement of ssd1 gene via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation was conducted in both fungi. Consequently, phenotypic characterization of wild-type fungi was conducted after growth in five different media. Cytotoxicity of crude extracts was tested on both normal (Vero-B4) and cancer (Hela S3) mammalian cell lines, antifungal, and antibacterial activity. The deletion vectors (pSJ-SSD1-HPT) were successfully constructed, however, no mutants were generated. The crude extracts presented activity against normal and cancer cells, bacteria, and fungi, although these abilities varied according to growth media. In Hela S3 cells and test organisms, extracts from growth in nutrient-rich media presented higher activities. Also, HPLC analysis of the extracts revealed a total number of analytes higher when growth was on BAF medium. Thus, in chapter 2, this medium was used for large-scale fermentation of L. hormozganensis, to isolate active secondary metabolites. After extraction of crude extracts -mycelium and culture filtrate - the latter was submitted to solid phase extraction, preparative HPLC and HPLC-MS. Pure compounds identified as 4-ethylaniline (27.3 mg) and orsellinic acid (1.5 mg) were reported for the first time in L. hormozganensis. The compound 4-ethylaniline displayed no effects on bacteria, fungi, plants, mammalian and human cancer cells, suggesting that this compound is not involved in virulence by the fungus. The role of the two compounds remains unclear. The results on these compounds characterization reveal that further studies are required to understand their involvement - as well as other metabolites produced by this fungus - in potential virulence mechanisms towards the human host.
As alterações climáticas globais podem levar a interações de fungos patogénicos com novos hospedeiros, incluindo de reinos diferentes. Para que isto ocorra, os fungos necessitam de desenvolver mecanismos específicos de virulência, por exemplo por produção de fatores de virulência. Alguns fungos fitopatogénicos da família Botryosphaeriaceae são patogénicos oportunistas humanos. Além disso, o género Lasiodiplodia tem sido relatado em várias infeções humanas. Contudo, os mecanismos de virulência por detrás desta capacidade ainda carecem de investigação. O objetivo desta tese consistiu no estudo da virulência em humanos por L. theobromae - estirpe LA-SOL3 - (isolado da videira) e L. hormozganensis - estirpe CBS339.90 - (isolado de paciente humano). No capítulo 1 realizou-se a substituição do gene ssd1 nos fungos por transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens. Consequentemente, a caracterização fenotípica dos fungos “selvagens” foi realizada após o seu crescimento em cinco meios diferentes. A citotoxicidade dos extratos brutos foi testada em células de mamíferos normais (Vero-B4) e cancerígenas (Hela S3), atividade antifúngica e antibacteriana. Os vetores de deleção (pSJ-SSD1-HPT) foram construídos com sucesso, porém não foram gerados mutantes. Os extratos brutos apresentaram atividade contra células normais e cancerígenas, bactérias, e fungos, embora os resultados variem de acordo com o meio de crescimento: em células Hela S3 e nos organismos teste, extratos de crescimento em meios ricos em nutrientes apresentaram maiores atividades. A análise dos extratos por HPLC revelou um número total de analitos maior no crescimento em meio BAF. No capítulo 2, este meio foi usado para fermentação em larga escala de L. hormozganensis, para isolar metabolitos secundários ativos. Após extração dos extratos brutos - micélio e meio extracelular - o último foi submetido a extração em fase sólida, HPLC preparativo e HPLC-MS. Compostos puros identificados como 4-etilanilina (27,3 mg) e ácido orselínico (1,5 mg) foram relatados pela primeira vez em L. hormozganensis. O composto 4-etilanilina não apresentou efeitos contra bactérias, fungos, plantas, células normais e cancerígenas, o que sugere não estar envolvido na virulência do fungo. O papel dos dois compostos ainda não está clarificado. O resultado da caracterização destes compostos revelou que são necessários mais estudos para compreender o seu envolvimento - assim como de outros metabolitos produzidos pelo fungo - em possíveis mecanismos de virulência para o hospedeiro humano.
URI: http://hdl.handle.net/10773/28314
Appears in Collections:DBio - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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