Dogs (Canis lupus familiaris) from the Iberian Peninsula dated to the Chalcolithic period: a genomic approach

Abstract

Os cães existem na Península Ibérica pelo menos desde o Paleolítico Superior; o resto arqueológico mais antigo data há cerca de 16,000 AP (Erralla, Espanha). Existem diferentes teorias sobre a origem dos cães na Europa. Estudos anteriores indicam que os cães podem ter chegado à Europa a partir de uma população domesticada de lobos oriundos da Ásia Oriental, ou a partir de duas populações de lobos geneticamente distintas da Eurásia Oriental e Ocidental, domesticadas independentemente, e que mais tarde, a população de cães da Eurásia Oriental se espalhou e substituiu parcialmente a população da Eurásia Ocidental. Um estudo recente focando na composição genética de 6 cães Ibéricos do período Mesolítico, sugeriu que uma domesticação local na Península Ibérica pode ter ocorrido na Europa pré-Neolítica. Considerando o debate mantido sobre a origem dos cães, é crucial desvendar a composição genética de populações passadas e periféricas da Europa – usando métodos específicos para recuperar e analisar o DNA ancestral, de diferentes períodos, a fim de investigar a origem e a trajetória evolutiva dos cães no seu global. Nomeadamente, pode revelar-se importante por fornecer dados sobre uma possível contribuição do lobo Ibérico para a origem dos primeiros cães Ibéricos e informação genómica potencialmente útil para a detecção de eventos de hibridação histórica entre o cão e o seu parente selvagem, o lobo Ibérico – uma subespécie endêmica e atualmente considerada “Em perigo” de extinção. Esta informação pode ser englobada aquando a definição de medidas de gestão e conservação futuras para a espécie selvagem lobo Ibérico. Neste trabalho, uma abordagem genómica (Next Generation Sequencing, NGS) foi a escolhida para recuperar sequências do genoma mitocondrial (mt) e nuclear de Canis de três sítios arqueológicos Ibéricos datados do Calcolítico [ca. 5,000- 4,000 anos atrás]: dois cães de Leceia em Oeiras, Portugal; dois cães de Casetón de La Era em Valladolid, Espanha; e um lobo de Penedo de Lexim em Mafra, Portugal. Utilizando as ferramentas de bioinformática actuais, esses genomas foram identificados e compilados. Além disso, para entender a relação de populações passadas/modernas, construiu-se uma rede filogenética (baseada num fragmento parcial da região controlo do mtDNA) reunindo 254 sequências de Canis, bem como uma árvore filogenética de 23 mitogenomas de Canis disponíveis em bases dados públicos. Embora a recuperação e análise do genoma nuclear sejam um maior desafio se proveniente de amostras ancestrais, este foi investigado para a identificação do sexo molecular desses 5 espécimes. Relativamente ao estudo dos cães pré-históricos da Ibéria, esta é a primeira tentativa de aplicar com sucesso o método NGS para investigar a sua composição genética. Neste estudo, foi possível: gerar sequências do genoma mitocondrial (com 1x a 17x de cobertura) e recuperar entre 0.09% e 3.75% do genoma nuclear endógeno das 5 amostras do Calcolítico; identificar haplótipos de DNA mitocondrial e atribuí-los a dois (A e C) dos quatro principais haplogrupos descritos para os cães (A, B, C e D); gerar dados genómicos de um lobo Ibérico do Calcolítico que, tanto quanto investiguei, constituem os primeiros dados genómicos de um espécime de lobo da Ibéria e desta cronologia. Os resultados mostram que os cães Ibéricos do Calcolítico apresentavam a mesma frequência de haplótipos do Haplogrupo A (Hg anteriormente presente neste território, em contraste com as outras regiões da Europa), bem como do Haplogrupo C (já presente em outras regiões da Europa desde o Paleolítico).

Domestic dogs exist in the Iberian Peninsula at least since the Upper Late Palaeolithic; the oldest remain dated to 16,000 BP years old (Erralla, Spain). There are different theories about the origins of European dogs. Previous studies indicated that dogs may arrived in Europe from an Eastern Asia domesticated population of wolves, or that two genetically distinct wolf populations in Eastern and Western Eurasia may have been independently domesticated, and that afterwards the Eastern dog population spread and partially replaced an indigenous Western Eurasian dog population. A recent study focusing in the genetic composition of 6 Mesolithic Iberian dogs reported that a local domestication in the Iberia Peninsula may have occurred in pre-Neolithic Europe. Considering the debated origin of Iberian dogs, it is crucial to unravel the genetic composition of past European peripheral populations - using specific methods to recover and analyse ancient DNA, from different periods in order to further investigate their origins and evolutionary trajectories. Additionally, it may prove important to provide data on a possible contribution of the Iberian wolf to the origin of the first Iberian dogs and genomic information potentially useful for the detection of historical hybridization events between the dog and its wild relative, the Iberian wolf – a subspecies and an endemism currently considered “Endangered”. This information can be included in the definition of future management and conservation measures for the wild Iberian wolf species. In this work, a genomic approach (Next Generation Sequencing, NGS) was carried out to recover mitogenome and nuclear genomic data of Canis from three Iberian archaeological sites dated to the Chalcolithic [ca. 5,000-4,000 years BP], in particular: two dogs from Leceia in Oeiras, Portugal; two dogs from Casetón de La Era in Valladolid, Spain; and one wolf from Penedo de Lexim in Mafra, Portugal. Using the most up-to-date bioinformatic tools, their mitochondrial (mt) and nuclear genomes were sequenced. In addition, to understand the relationship of past/extant populations, a phylogenetic network (based on a partial fragment of the mtDNA control region) comprising 254 Canis sequences, as well as a phylogenetic tree of 23 Canis mitogenomes, publicly available, were constructed. Furthermore, the nuclear genome, although more challenging to recover and analyse from ancient samples, was investigated to molecularly assess the sex of these 5 Canis specimens. Regarding ancient Iberian dogs, this is the first attempt to successfully apply NGS methods to investigate their genomic composition. In this study, it was possible to: generate the draft of mitochondrial genomes (coverages ranged between 1x and 17x) and recover between 0.09% and 3.75% of endogenous nuclear genomic data of these 5 Canis specimens; identify mitochondrial DNA haplotypes and assign those to 2 (A and C) of the four major dog haplogroups described (A, B C and D); generate genetic data from a Chalcolithic wolf - to the best of my knowledge this is the first genomic data available from an Iberian wolf specimen from this chronology. The results shown that the Chalcolithic Iberian dogs had about the same frequency of Haplogroup A (previously present in this territory, but contrasting with other European regions), as well as of the Haplogroup C (already present in other European regions since the Paleolithic).