Inativação fotodinâmica do fungo patogénico da videira Lasiodiplodia theobromae

Abstract

A viticultura é uma atividade de grande importância económica por todo o mundo. Ao longo dos anos, a sustentabilidade das vinhas tem sido constantemente ameaçada por diversos fungos patogénicos causando prejuízos económicos de grande escala. Recentemente, o fungo Lasiodiplodia theobromae tem ganho grande notoriedade como fitopatogénico, provocando o cancro da videira e “dieback”. Várias estratégias de controlo deste fungo foram já aplicadas para mitigar a sua propagação. Estas estratégias passam por ações preventivas a nível cultural, químico e biológico. No entanto, nenhuma das tentativas de controlo fitosanitário implementadas mostrara ser eficaz ou ambientalmente inóqua. Apesar de ainda não ter sido aplicada no combate a L. theobromae, a terapia fotodinâmica tem mostrado ser uma abordagem bastante promissora contra vários fungos fitopatogénicos. Este trabalho teve como objetivo avaliar a eficiência da inativação fotodinâmica, com luz solar e luz PAR contínua, de fotossensibilizadores (PSs) sintéticos comerciais [azul de toluidina O (TBO] e azul de metileno (AM)], não comerciais do tipo porfirínico [um derivado porfirínico tetracatiónico (Tetra-Py⁺-Me) e quatro clorinas catiónicas (H₂ChlTPPF₁₆[SPyM]₄, ZnChlTPPF₁₆[SPyM]₄, H₂ChlTPPF₁₆[NPyOM]₄ e ZnChlTPPF₁₆[NPyOM]₄)], e ainda a riboflavina, considerada um PS natural. A exposição à luz solar de L. theobromae na presença de 1,0 e 2,0 mM de TBO e 2,66 e 5,32 mM de Riboflavina não provocou a inibição do crescimento quando o PS foi adicionado ao meio semi-sólido de aveia ou aplicado diretamente à superfície do meio de cultura. No entanto, o AM nas concentrações de 1,0 e 2,0 mM reduziu o crescimento do micélio em 60% e 83%, respetivamente. Esta inibição no crescimento apenas se verificou para o método de incorporação do PS no meio semi-sólido. Com irradiação com luz branca artificial (PAR) contínua e na presença de 1,0 mM de TBO, 1,0 mM de AM, 2,66 mM de riboflavina, 50 μM dos derivados sintéticos Tetra-Py⁺-Me, H₂ChlTPPF₁₆[SPyM]₄, ZnChlTPPF₁₆[SPyM]₄, H₂ChlTPPF₁₆[NPyOM]₄ e ZnChlTPPF₁₆[NPyOM]₄ houve inibição significativa do crescimento do micélio. Esta inibição foi de 100% para o TBO, AM, Tetra-Py⁺-Me, ZnChlTPPF₁₆[SPyM]₄ e H₂ChlTPPF₁₆[NPyOM]₄, 99% para ZnChlTPPF₁₆[NPyOM]₄, 96% para H₂ChlTPPF₁₆[SPyM]₄ e 90% para a riboflavina. No entanto, em todas as situações testadas, houve recuperação do crescimento uma vez terminada a exposição à luz, passando de 100% de inibição para recuperação total após 4 dias de incubação no escuro. Na presença de 50 μM de AM ou 5,0 μM de Tetra-Py⁺-Me e irradiação contínua com luz PAR, observou-se que a produção de biomassa foi reduzida em 57% e 54%, respetivamente. O tipo de mecanismo envolvido nesta inativação fotodinâmica foi avaliado utilizando-se scavengers de oxigénio singleto e radicais livres. Na presença de AM, o scavenger azida de sódio não exerceu nenhum efeito de proteção na inativação do fungo ao contrário do D-manitol, confirmando que os radicais livres (mecanismo tipo I) são as espécies reativas de oxigénio (ROS) preponderantes na inativação fotodinâmica de L. theobromae com AM. Os resultados demonstram que a inativação fotodinâmica é uma estratégia interessante para o controle de fungos fitopatogénicos mas que existem ainda dificuldades a ultrapassar, nomeadamente as relacionadas com a recuperação do fungo, uma vez interrompida a exposição à luz. Contudo, o uso de pastas, emulsões ou tintas contendo o PS nas feridas expostas de videiras infetadas pode proporcionar melhor proteção em comparação com a pulverização com soluções líquidas.

Viticulture is an economic activity of global relevance. Over the years, the sustainability of vineyards has been threatened by several pathogenic fungi causing large-scale economic losses. Recently, the fungus Lasiodiploda theobromae has gained notoriety as the main causal agent of vine disease, triggering trunk cancer and dieback. Several control strategies have already been implemented to mitigate the spread, from preventive cultural, to chemical and biological measures. However, none of these control attempts proved to be either effective or environmentally friendly. Although it has not yet been used in L. theobromae, photodynamic inactivation has shown to be a very promising approach against several phytopathogenic fungi. The objective of this work was to evaluate the efficiency of the photodynamic inactivation of L. theobromae with the synthetic photosensitizers (PSs) toluidine blue O (TBO) and methylene blue (MB), the cationic porphyrin (Tetra-Py+-Me), chlorines (H₂ChlTPPF₁₆[SPyM]₄, ZnChlTPPF₁₆[SPyM]₄, H₂ChlTPPF₁₆[NPyOM]₄ and ZnChlTPPF₁₆[NPyOM]₄) and the natural photosensitizer riboflavin, with natural sunlight and continuous PAR light irradiation. Exposure to sunlight in presence of 1,0 and 2,0 mM of TBO and 2,66 and 5.32 mM of riboflavin did not induce inhibition of L. theobromae growth when the PS was either added to soft oat medium or directly spread on the surface of oat agar. However, when 1,0 and 2,0 mM of MB was incorporated in the soft agar layer, there was a reduction of L. theobromae growth by 60% and 83%, respectively. Continuous irradiation with PAR light in presence of 1,0 mM TBO, 1,0 mM MB, 2,66 mM riboflavin, 50 μM of porphyrinic derivatives Tetra-Py+-Me, H₂ChlTPPF₁₆[SPyM]₄, ZnChlTPPF₁₆[SPyM]₄, H₂ChlTPPF₁₆[NPyOM]₄ and ZnChlTPPF₁₆[NPyOM]₄ inhibited mycelial growth. This inhibition was 100% for TBO, MB, Tetra-Py+-Me, ZnChlTPPF₁₆[SPyM]₄ and H₂ChlTPPF₁₆[NPyOM]₄, 99% for ZnChlTPPF₁₆[NPyOM]₄, 96% for H₂ChlTPPF₁₆[SPyM]₄, and 90% for riboflavin. However, once irradiation was terminated, there was a full recovery of mycelium developed during a period of 4 days of dark incubation. In the presence of 50 μM of MB and 5,0 μM of Tetra-Py+-Me and under continuous irradiation with PAR light, biomass production was reduced by 57% and 54%, respectively. The type of mechanism involved in the photodynamic inactivation was determined using specific scavengers. In the presence of MB, sodium azide had no protective effect on inactivation of this fungus unlike D-mannitol, confirming that free radicals (type I mechanism) are the main reactive oxygen species (ROS) involved in the photodynamic inactivation of L. theobromae with this PS. The results demonstrate that the photodynamic inactivation can be an interesting strategy for the control of phytopathogenic fungi, but that there are still difficulties to overcome, namely those related to fungus regrowth upon ending light exposure. However, the use of PS-containing pastes, emulsions or paints in the exposed wounds of infected vines may provide better protection compared to pulverization with liquid solutions.