Benefits of a marine macroalgae enriched-diet on the biochemical status of the eyes and brain in fish exposed to formalin

Abstract

Many health benefits have been associated with bioactive compounds of marine macroalgae (MM), including protection against oxidative stress and synaptic loss that are hallmarks of human neurodegenerative disorders. While the benefits of macroalgae have been largely explored with a focus on human health associated with neurological status (among others), advantages to farmed fish health remain elusive. Based on similarities of neurological pathways between fish and mammals, as well as on identical structures of the brain and sensory organs, beneficial effects of MM-enriched feeds can be expected on fish. These benefits are probably more evident when fish are under exogenous challenging conditions to their neurological status, as can be the case of formalin exposure (a frequently used disinfectant in aquaculture), which has been associated with neurotoxic effects in mammals. The current dissertation was designed under this context, aiming to address, for the first time, the antioxidant and neurotransmission protection afforded by a MM-enriched diet to the eyes and brain of the gilthead seabream (Sparus aurata) under baseline conditions, as well as after formalin exposure. For this purpose, fish were fed for 2 months with a MM-enriched feed [total incorporation of 5%, with the species Fucus vesiculosus, Gracilaria gracilis and Ulva rigida in equal parts - algae supplementation fish group (A)], while non-supplemented fish were fed with a standard diet (S) (without MM). Then, both dietary background groups were subjected to a formalin (F) bath for 1 hour (fish groups AF and SF). Such formalin treatment was repeated 2 days later. Control groups, unexposed to formalin, were maintained along the experiment (A and S) that lasted 18 days after the first formalin exposure. During the whole experiment, fish were fed twice a day, while water quality was monitored daily. Fish of the different groups (A, S, AF, SF) were sacrificed 4 and 18 days after the formalin exposure, with the eyes and brain being collected for the determination of the following biochemical parameters: (i) enzymatic (catalase (CAT), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx), glutathione - s - transferase (GST), glutathione reductase (GR) and non-enzymatic antioxidants (total glutathione (GSHt)); (ii) damage indicators (lipid peroxidation – LPO; protein oxidation - PO); (iii) acetylcholinesterase (AChE) activity used in this research as a proxy of neurotransmission. Besides that, a gross assessment of fish condition was made. No significant changes were recorded on weight, total length and condition factor of the fish over the experimental time, regardless the treatment. This suggests that MM can be included in gilthead seabream diet without compromising growth rates, and therefore with no detrimental effect on fish production revenues. Differently, two months after macroalgae supplementation, there were a few significant alterations on the eyes and brain biochemical parameters, although difficult to be straightforward associated to the different dietary backgrounds afforded to S. aurata. Moreover, lipid peroxidation and protein oxidation in the eyes of fish supplemented with MM and non-exposed to formalin (control group - A) was recorded at day 4, fetching some doubts on the benefits of the macroalgae-enriched diet per se, i.e., in the absence of a pro-oxidant challenge. Four and 18 days after the formalin exposure, the antioxidants, lipid peroxidation and the AChE activity showed similar variations in the brain of the supplemented fish, represented by significant increases in A and AF conditions. This pattern similarity may indicate that MM dietary supplementation can be important to modulate the brain defence mechanisms in S. aurata. Yet, in the 18 days period it was reported a few exceptions. However, upon formalin exposure, the effects of MM supplementation on the pro-oxidant status and neurotransmission of those organs were remarkable. Four days after formalin exposure, fish fed with a macroalgae-supplemented diet (AF) displayed an improvement on the non-enzymatic antioxidant defense of the eyes against formalin, as depicted on the increase of total glutathione levels (GSHt). Accordingly, MM-enriched diet impaired the occurrence of protein oxidation and AChE enhancement promoted by formalin in the eyes of fish fed with a standard diet (SF). After 18 days, it was evident a persistence of the macroalgae protection in the eyes, as depicted on the capacity to avoid formalin-induced GSHt depletion, oxidative stress (as PO and LPO increases) and neurotoxicity (as AChE inhibition) observed in the eyes of non-supplemented fish (SF). A delayed impact of formalin was perceived in the brain in comparison to the eyes, since formalin effects were detected only 18 days after formalin exposure. By this time, lipid peroxidation was prevented in fish supplemented with macroalgae (AF), which cannot be dissociated from a notorious increase on GSHt content (that also occurred in fish fed with standard diet - SF). Formalin induced a late effect (day 18) on AChE as displayed by its activity increase, suggesting an imbalance on the cholinergic homeostasis, which was not prevented by the macroalgae enrichment. Results on AChE in the brain did not unveil the benefits of MM on neurotransmission. In conclusion, formalin presents a higher and earlier effect on S. aurata eyes when compared with the brain tissue, probably associated with its exposure route (water). The physiological alterations provoked by the formalin brought into light the shielding proprieties of MM supplementation in the fish neurosensory function. However, the MM beneficial proprieties deserve more research under the aquaculture context, specifically at the level of neuronal and sensory effects of formalin.

Vários benefícios para a saúde humana têm vindo a ser associados a compostos bioactivos de macroalgas marinhas (MM), compreendendo um aumento da proteção contra o stress oxidativo e perda de sinapses, que são processos tipicamente envolvidos em distúrbios neurodegenerativos. De facto, os benefícios das macroalgas têm sido amplamente investigados com enfoque nas condições neurológicas (entre outras) em humanos, enquanto que as suas vantagens na saúde de peixes em aquacultura permanecem pouco exploradas. Tendo em conta as semelhanças das vias neurológicas entre peixes e mamíferos, assim como as analogias estruturais do cérebro e dos órgãos sensoriais, são expectáveis efeitos benéficos de uma dieta enriquecida em MM também em peixes. Estes benefícios são, provavelmente, mais evidentes quando os peixes estão sujeitos a condições exógenas que possam desafiar o seu estado neurológico, como poderá ser o caso da formalina (desinfectante usado frequentemente em aquacultura), que já foi associada a efeitos neurotóxicos em mamíferos. A presente dissertação foi desenhada neste contexto, com o objectivo de abordar, e pela primeira vez, a proteção antioxidante e da neurotransmissão conferida por uma dieta suplementada com MM em olhos e cérebro de dourada (Sparus aurata) em condições de base, assim como após exposição a formalina. Com este objectivo, os peixes foram alimentados durante 2 meses com uma dieta suplementada com MM [incorporação total de 5 %, com as espécies Fucus vesiculosus, Gracilaria gracilis e Ulva rígida em partes iguais – grupo de peixes suplementado com algas (A)], enquanto que os peixes não suplementados foram alimentados com uma ração padrão/standard (S) (alimentação sem MM). De seguida, os dois grupos com diferentes dietas de base foram sujeitos a um banho de formalina (F) durante 1 hora (grupos SF e AF). O tratamento com formalina foi repetido 2 dias mais tarde. Os grupos controlo, não expostos a formalina, foram mantidos ao longo da experiência (S e A), que teve uma duração de 18 dias após a 1ª exposição. Os peixes dos diferentes grupos (S, A, SF, AF) foram sacrificados ao fim de 4 e 18 dias após a exposição à formalina, sendo que os olhos e o cérebro foram recolhidos para a determinação dos seguintes parâmetros bioquímicos: (i) antioxidantes enzimáticos (catalase (CAT), superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx), glutationa - s - transferase (GST), glutationa redutase (GR) e não enzimáticos (glutationa total (GSHt)); (ii) indicadores de dano (peroxidação lipídica – LPO e oxidação proteica (PO); (iii) actividade da acetilcolinesterase (AChE), usada como um indicador da neurotransmissão. Além disso, foi feita uma avaliação simplificada da condição geral dos peixes. Não foram registadas alterações significativas no peso dos peixes, comprimento total e índice de condição ao longo do período experimental, para qualquer dos tratamentos. Este resultado sugere que as MM podem ser incluídas na dieta da dourada sem comprometer a sua taxa de crescimento e, portanto, sem vir a ter um efeito negativo nos dividendos associados à produção de peixe. Em contrapartida, foram registadas algumas alterações significativas nos parâmetros bioquímicos medidos nos olhos e cérebro dos peixes que estiveram 2 meses sob uma dieta enriquecida em MM, embora essas alterações tenham sido difíceis de interpretar por associação direta ao tipo de dieta fornecida. Por outro lado, aos 4 dias observou-se um aumento da peroxidação lipídica e da oxidação proteica nos olhos dos peixes suplementados com MM e não expostos à formalina (grupo controlo – A). Este resultado levantou algumas dúvidas sobre os benefícios de uma dieta enriquecida em MM per se, ou seja em ausência de um desafio pró-oxidante. De um modo geral, aos 4 e 18 dias após a exposição à formalina, foram registados padrões de variação idênticos para os antioxidantes, peroxidação lipídica e a atividade da AChE no cérebro de peixes suplementados com MM, representados por aumentos significativos nas condições A e AF. Esta semelhança de padrões de variação parece indicar que uma dieta rica em MM poderá modular os mecanismos de defesa no cérebro de S. aurata. Foram, contudo, registadas algumas exceções 18 dias após a exposição a formalina. É de salientar que os efeitos da suplementação com MM no estado pró-oxidante dos olhos e cérebro, assim como na neurotransmissão, se tornaram mais evidentes após a exposição dos peixes a formalina. Designadamente, 4 dias após a exposição a formalina, os peixes alimentados com uma dieta suplementada em MM (AF) apresentaram uma melhoria na defesa antioxidante não enzimática nos olhos, tal como demostrado pelo aumento dos níveis da GSHt. Por conseguinte, uma dieta enriquecida em MM preveniu a ocorrência de oxidação das proteínas, assim como o aumento de AChE que terá sido promovido pela formalina nos olhos de peixes sob uma dieta standard (SF). Dezoito dias mais tarde, essa proteção terá continuado a manifestar-se nos olhos dos peixes alimentados com MM, tal como foi traduzido pela sua capacidade em prevenir a depleção de GSHt induzida pela formalina, assim como a ocorrência de stress oxidativo (aumento de PO e LPO) e aumento de sinais de neurotoxicidade (pela inibição de AChE), tal como foi registado nos olhos dos peixes sob uma dieta standard (grupo SF). Os resultados apontam para um impacto da formalina no cérebro dos peixes mais tardio do que aquele que foi registado nos olhos, dado que foram observados efeitos unicamente 18 dias após a exposição. Neste período, a peroxidação lipídica foi prevenida no cérebro dos peixes suplementados com MM (AF), o que poderá estar associado ao aumento notório de GSHt (que também foi registado em peixes alimentados com dieta padrão – SF). A formalina induziu um efeito tardio (18 dias) na AChE, tal como demostrado pelo aumento da sua actividade. Este resultado sugere um desequilíbrio na homeostase colinérgica do cérebro, que não terá sido prevenido pelo enriquecimento em MM. De um modo geral, os resultados da actividade de AChE no cérebro não apontaram para benefícios das MM na neurotransmissão. Em conclusão, a formalina teve um efeito superior nos olhos de S. aurata do que no cérebro, tendo sido esse efeito registado mais precocemente. A água é a via de exposição dos peixes à formalina, o que poderá contribuir para explicar o resultado anterior. As alterações fisiológicas induzidas pela formalina colocaram em evidência as propriedades protetoras que uma dieta enriquecida em MM poderá ter na função neuro-sensorial de peixes. Contudo, é necessária ainda mais investigação, em particular no contexto da aquacultura, relativamente às propriedades das MM, especificamente ao nível do cérebro e estruturas sensoriais após exposição dos peixes a formalina.