Unreveling pathways of cyto and genotoxicity of AgNP in lung cells: in vitro and in vivo approach

Abstract

Silver nanoparticles (AgNPs) have been extensively used due to their antimicrobial and anti-inflammatory properties. The unique properties have been exploited in a wide range of fields, such as, medical, scientific, industrial, and in consumer products allowing the exposure through various routes including inhalation, ingestion and dermal. Although, there are many studies reporting the effects of AgNPs, is still not clear whether their toxicity is attributed to AgNPs intrinsic toxicity and/or from the released ions. Therefore, this study was sub-divided in two main hypotheses: A) small differences on AgNPs size enough to induce different toxicity profiles in lung (cell line A549) and bone cells (cell line MG-63) grown in vitro; B) the toxicity, distribution and excretion kinetics AgNPs upon instilled mice in vivo is size dependent. Therefore, in the in vitro studies, A549 and MG-63 cell lines were exposed to AgNPs with 10 nm (AgNP10) and 20 nm (AgNP20) (up to 100μg/mL), as well as ionic silver (as AgNO3). The effects on cell viability, proliferation, induced apoptosis, DNA damage and cell cycle dynamics were assessed. Also, the contribution of ionic silver (due to AgNP dissociation) on the toxicity of AgNPs was determined. Results for A549 cell line showed that for concentrations <5μg/mL, AgNP20 induced higher mortality, while AgNP10 showed higher toxicity at doses >50μg/mL. Also, for doses >50μg/mL, AgNP10 induced severe DNA damage (comet class 3-4), cell cycle arrest at G2 and induction of late-apoptosis. AgNP20 induced arrest at S phase and increase in the % sub-G1, that was not recovered after 48h. AgNP20 also induced late-apoptosis/necrosis. MG-63 results showed that AgNP20 induced cell cycle arrest at G0/G1 and decrease in cell proliferation, while AgNP10 induced severe DNA damage which lead to death by necrosis. Finally, combining both A549 and MG-63 results, we concluded that A549 are more sensitive to AgNPs and the toxicity was highly dependent on size and concentration. Additionally, a small difference in AgNP size is enough to induce a size-dependent toxicity in both cell lines, but it was not enough to influence the uptake rate by both cell lines. AgNO3 in short exposure (48h) is more toxic compared to AgNPs, however, for longer exposures AgNPs shown higher toxicity completely inhibiting cell growth. Silver toxicity, distribution and excretion of two different sizes of AgNPs (5 and 50nm) and ionic silver (AgNO3) were assessed in vivo in mice. Two experiments were performed: A) acute exposure - endpoint evaluation after 1 or 2 intratracheal instillation (IT) and recovery for 7 days; B) chronic exposure - endpoint evaluation after repeated ITs, once a week for 5 weeks. Mice were allowed to recover for 1, 2, 7, 14, 21 or 28 days after the last instillation (dpi). At the end of both studies, blood samples were collected for hematology, and the organs (brain, lung, liver, heart, spleen and kidney), urine and feces were collected to evaluate the silver concentration by ICP-MS. Lung and liver tissues were collected to GSH analysis. For the acute study only, lung tissues were collected to study the effects on the metabolic profile by NMR and for the chronic study, data was gathered to build a Physiologically based pharmacokinetic (PBPK) model. Overall, for the acute study the effects of the instilled AgNPs were dependent on size and number of instillations. The AgNP5 shared a similar inflammatory effect with AgNO3, while AgNP50, seemed to have higher influence on the innate immune system. Regarding the biodistribution results, the highest concentration of silver obtained was in the lungs, followed by blood, spleen, kidneys and liver. AgNP5 showed a faster and higher distribution to all organs but with a high rate of accumulation. The AgNP50 remained mostly in the blood with only a small fraction of silver detected in the organs, although, the small concentration of silver distributed to the organs, presented a high rate of excretion. After 2 IT of AgNPs or AgNO3, the redox state of the lungs suggested an oxidative stress response correlated to higher amounts of silver. In the liver, there was an increase in GSH for AgNP50 or AgNO3, which could be related to biliary excretion of silver as Ag-GSH complex. NMR profiling of lung tissues revealed several Ag-induced alterations in metabolites involved in different pathways, such as glycolysis and TCA cycle amino acid metabolism, phospholipid metabolism and antioxidant defense. Notably, most of the metabolic changes observed after 1 IT were reversed in animals subjected to 2 IT of AgNPs, suggesting adaptation mechanisms to recover homeostasis. Additionally, AgNO3 showed no significant alterations after 2 IT. For the chronic study, hematology results showed that AgNP5 induced major and longer lasting toxicity compared to AgNP50 and AgNO3. The redox state of both lung and liver, overall, showed an oxidative stress response which could be related to the silver exposure. The major route for excretion seems to be through the urine, especially for AgNP50 and AgNO3. Also, a high concentration of AgNP5 was also found in feces. The PBPK model was not successful predicting the real distribution of particles from 5 – 50nm. From the 7 specific tissues, the modelled data for the heart and liver were in line with the in vivo data. Overall, this study suggests that even small differences on AgNPs size are enough to induce different outcomes and effects in human cell lines. Additionally, when comparing bigger sizes differences, along with the size, the number of exposures seems to play a role in the AgNPs effects, distribution and elimination from the body.

As nanopartículas de prata (AgNPs) têm sido amplamente utilizadas devido às suas propriedades antimicrobianas e anti-inflamatórias. Em virtude das suas propriedades únicas, as AgNPs têm vindo a ser incorporadas numa vasta gama de setores, tais como, na ciência, na medicina, na indústria e em diversos produtos de consumo, presentes no nosso dia-a-dia. Esta ubiquidade conduz à possibilidade de exposição através de várias vias, sobretudo, pela via inalatória, oral e dérmica. Embora existam diversos estudos que reportam os efeitos das AgNPs, ainda não é claro se a sua toxicidade é intrínseca ou originada pela libertação de iões de prata. Assim, neste estudo são propostas duas hipóteses: A) pequenas diferenças no tamanho das AgNPs são suficientes para induzir diferentes perfis de toxicidade em células de pulmão (linha celular A549) e osso (linha celular MG-63) in vitro; B) a toxicidade, distribuição e excreção das AgNPs é condicionada pelo tamanho, após-instilação in vivo em ratinhos. Nos estudos in vitro, as linhas celulares foram expostas a AgNPs com 10nm (AgNP10) e 20nm (AgNP20) (até 100 μg/mL), bem como à prata iónica (na forma de AgNO3). Após exposição foram estudados diferentes parâmetros, tais como, a internalização das AgNPs pelas linhas celulares, a viabilidade celular e proliferação, alterações na dinâmica do ciclo celular, indução de micronúcleos e a morte celular por apoptose e/ou necrose. Além disso, estudou-se a contribuição da prata iónica na toxicidade das AgNPs nas células. Os resultados da linha celular A549 mostraram que as AgNP20 reduziram a actividade metabólica para doses <5 μg/mL, enquanto que as AgNP10 induziram toxicidade metabólica a doses > 50 μg/mL. Também para doses > 50 μg/mL, AgNP10 induziu dano severo no DNA (cometa classe 3-4), paragem do ciclo celular em G2 e indução de apoptose tardia. AgNP20 induziu paragem na fase S e aumentou a % sub-G1 após 24h de exposição, efeito que se manteve após 48h de exposição. Este tamanho induziu também apoptose tardia/necrose nas células A549. Os resultados de MG-63 mostraram que as AgNP20 induziram a paragem do ciclo celular em G0/G1 e diminuição da proliferação celular, enquanto que as AgNP10 induziram um dano severo no DNA, levando a morte por necrose. Combinando os resultados de A549 e MG-63, concluíu-se que a linha celular A549 é mais sensível às AgNPs e que a toxicidade foi dependente do tamanho e da concentração utilizadas. Concluiu-se, ainda que, uma pequena diferença no tamanho de AgNPs foi suficiente para induzir diferentes respostas em ambas as linhas celulares, mas não foi suficiente para influenciar a taxa de internalização. O AgNO3 induziu maior toxicidade do que as AgNPs em curtas exposições (48h), contudo, a longo prazo, observou-se que, as AgNPs se tornaram mais tóxicas, inibindo completamente o crescimento de ambas linhas celulares. Nos estudos in vivo, avaliou-se a toxicidade, distribuição e excreção de prata de dois tamanhos diferentes de AgNPs (5 e 50nm) e prata iónica (AgNO3) em ratinhos. Foram realizados dois ensaios: A) exposição aguda - após 1 ou 2 instilações intratraqueais (IT) e recuperação durante 7 dias; B) exposição crónica - após repetidas ITs, administradas uma vez por semana durante 5 semanas. Neste ensaio, os animais recuperaram por 1, 2, 7, 14, 21 ou 28 dias após a última instilação (dpi). No final de ambos os estudos, foram recolhidas amostras de sangue para hematologia, e respetivos órgãos (cérebro, pulmão, fígado, coração, baço e rim), assim como, urina e fezes para avaliação da concentração de prata por ICP-MS. Tecidos de pulmão e fígado foram recolhidos para análises de GSH/GSSG. No estudo agudo, tecidos de pulmão foram ainda recolhidos para avaliar os efeitos no perfil metabólico por RMN e no estudo crónico, os dados recolhidos foram utilizados para construir um modelo farmacocinético baseado na fisiologia (PBPK). Em geral, no estudo agudo, os efeitos das AgNP instiladas mostraram ser dependentes do tamanho e do número de instilações. Sendo que as AgNP5 induziram um efeito inflamatório semelhante a AgNO3, enquanto que as AgNP50 mostraram ter maior influência no sistema imunitário inato. Quanto aos resultados da biodistribuição, a maior concentração de prata foi obtida nos pulmões, seguida de sangue, baço, rins e fígado. Mais especificamente, a AgNP5 mostrou uma distribuição mais rápida, mas também uma maior taxa de acumulação. Enquanto que as AgNP50 permaneceram maioritariamente no sangue com apenas uma pequena percentagem de prata distribuída para os órgãos, apesar disso, a quantidade de prata distribuída para os órgãos, apresentou uma alta taxa de excreção. Após 2 IT de AgNPs ou AgNO3, o estado redox do pulmão sugere uma resposta a stress oxidativo, correlacionada com o aumento de prata no pulmão. A GSH no fígado aumentou após 1 IT de AgNP50 e AgNO3, podendo estar relacionado à excreção biliar de prata como complexo Ag-GSH. O perfil metabólico dos tecidos pulmonares revelou uma série de alterações induzidas por Ag em metabolitos envolvidos em diferentes vias, como, glicólise, metabolismo do ciclo de Krebs, metabolismo de fosfolípidos e defesa antioxidante. Notavelmente, a maioria das alterações metabólicas observadas após 1 TI foram recuperadas ou alteradas nos animais submetidos a 2 IT, sugerindo mecanismos de adaptação para lidar com o insulto inicial e recuperar a homeostase. Adicionalmente, a exposição a AgNO3 não mostrou alterações significativas após 2 IT. Para o estudo crónico, os resultados da hematologia mostraram que as AgNP5 induziram uma toxicidade mais severa e por um maior período de tempo, comparado com AgNP50 e AgNO3. Em geral, após exposição crónica, o estado redox do pulmão e fígado mostrou indução de stress oxidativo que poderá estar relacionado com a exposição a prata. Os níveis de prata diminuíram ao longo do tempo nos órgãos dos animais tratados com AgNP50 e AgNO3, enquanto que nos ratinhos expostos a AgNP5, os níveis de prata apresentaram-se mais altos a 28 dpi, no pulmão, baço, rim, fígado e sangue. A principal via de excreção pareceu ser através da urina, especialmente para AgNP50 e AgNO3. Uma alta concentração de AgNP5 também foi verificada nas fezes. O modelo PBPK não se mostrou eficiente na previsão da distribuição de AgNPs com tamanho entre 5-50 nm. Para os 7 tecidos avaliados, os resultados do PBPK foram concordantes com os dados in vivo apenas para o coração e fígado. Em geral, este estudo sugere que pequenas diferenças no tamanho entre AgNPs são suficientes para induzir diferentes efeitos em linhas celulares humanas. Contudo, ao comparar diferenças de tamanhos maiores, para além do tamanho, o número de exposições parece desempenhar um papel nos efeitos, distribuição e eliminação das AgNPs