A cardosina A, uma proteinase aspártica vegetal como modelo para estudos de comportamento em solventes orgânicos : da biocatálise à química de proteínas

Abstract

A água é fundamental para a actividade enzimática e para a formação da estrutura tridimensional correcta das proteínas. Por esta razão, a maioria do nosso conhecimento sobre enzimas, baseia-se em experiências em que o componente maioritário é a água. Contudo, esta provou ser uma das variadas limitações à expansão das aplicações de enzimas como biocatalisadores, especialmente quando os substratos envolvidos são pouco solúveis em água. A introdução de solventes orgânicos no sistema reactivo, tem inúmeras vantagens. Estas incluem uma acção directa dos solventes nos substratos (melhorando a sua solubilidade) e nos produtos da reacção (aumentando ou diminuindo a sua solubilidade) aumentando, deste modo, a produtividade do sistema. Contudo tem sido descrito que a introdução de um solvente orgânico num sistema reactivo, pode introduzir alterações na actividade, estabilidade e termostabilidade, especificidade enzimática, imprimindo, deste modo propriedades novas a enzimas conhecidas. A cardosina A é isolada dos pistilos de Cynara cardunculus L. e constitui um excelente exemplo do restrito grupo de proteinases aspárticas isoladas e purificadas a partir de plantas. Neste trabalho, investigou-se o comportamento da cardosina A, na presença de solventes orgânicos como o n-hexano, isooctano, acetato de etilo, ou acetonitrilo, no que concerne a sua actividade, estabilidade e especificidade. De modo a atingir o objectivo proposto, tornou-se necessário desenvolver um método de purificação, que permitisse a purificação de quantidades elevadas de cardosina A. Tornou-se, também, necessário modificar o ensaio de actividade estabelecido, de modo a possibilitar a correcta quantificação da actividade da cardosina A na presença de solventes orgânicos. Os resultados obtidos mostram que o protocolo de purificação desenvolvido permite a purificação de, pelo menos, 5mg de cardosina A por extracção, o que corresponde a um aumento de 500% de enzima em relação ao protocolo anteriormente descrito. O ensaio de actividade mostrou ser sensível e exacto e, deste modo, adequado à determinação da actividade da cardosina A na presença de solventes orgânicos. Os resultados apresentados mostram que a cardosina A é activa na presença de solventes orgânicos, embora a sua estabilidade ao armazenamento seja reduzida, quando comparada com o meio aquoso, na presença de solventes como o acetato de etilo e acetonitrilo, que são os solventes com menor valor de log P. A especificidade da cardosina A mostrou ser dependente do solvente orgânico utilizado, embora, neste caso, as razões se prendam com uma alteração da estrutura do substrato ou alteração da solvatação do substrato pelo solvente, quando nos referimos a substratos complexos ou a uma verdadeira alteração da especificidade quando se tratou de substratos simples. A utilização de solventes orgânicos permitiu, ainda, a utilização da cardosina A como catalisador de síntese peptídica que se revelou ser uma ferramenta de grande importância no estudo da especificidade enzimática.

Water is fundamental for enzyme action and for the formation of the correct three-dimensional structure of proteins. For this reason, most of our current knowledge of enzymes has derived from experiments in which water is the most abundant component. But water has proven to be one of the several limitations for broadening the scope of applications of enzymes in biocatalysis, especially when the reactants involved are poorly water-soluble. The introduction of an organic solvent into the reaction system has numerous advantages. These include a direct action of the solvents on the reactants (improving their solubility) and on the reaction products (improving or diminishing their solubility), thereby increasing the productivity of the reaction system. Nevertheless, it has been documented that the introduction of an organic solvent into the reaction mixture may induce alterations on enzyme activity, enzyme stability and thermo-stability, and enzyme specificity thereby imprinting new properties to old enzymes. Cardosin A is isolated from the pistils of Cynara cardunculus L. and is a fine example of a small number of aspartic proteinases that have been isolated and purified from plants. In this work, the behaviour of cardosin A was investigated, in the presence of organic solvents as n-hexane, isooctane, ethyl acetate or acetonitrile either in terms of its activity, stability or specificity. In order to achieve this objective it was necessary to develop a purification procedure that allowed the purification of high quantities of cardosin A. It was also necessary to modify the current activity assay in order to correctly quantify cardosin A activity in the presence of organic solvents. The results obtained show that the developed purification procedure allows the purification of approximately 5mg of cardosin A per extraction what corresponds to a 500% increase of pure enzyme when compared to the previous described method. The activity assay has proved to be sensitive and accurate, and thus suitable to evaluate cardosin A activity in the presence of organic solvents. The results show that cardosin A is active in the presence of organic solvents, although its storage stability is depressed in the presence of acetonitrile and ethyl acetate, which are the solvents with lower log P value. Cardosin A specificity has shown to be dependent on the organic solvent used, but in this case, the reasons relate a probable substrate structure alteration and alteration of substrate solvation by the solvent, in the case of complex substrates or a real specificity alteration in the case of simpler substrates. The use of organic solvents allows the utilisation of cardosin A as a catalyst in peptide synthesis what has revealed to be tool of great importance in the study of enzymatic specificity.