Biologia molecular de corinebactérias produtoras de aminoácidos [Texto policopiado] : análise do genoma de Brevibacterium Lactofermentum ATCC 13869

Abstract

A estirpe Brevibacterizrnz lactofemzentunz ATCC 13869 pertence ao grupo das corinebactérias. Esta estirpe e outras com ela relacionadas, como por exemplo Corynebacterizínz glzrtarlzicum ATCC 13032, são referidas de um modo genérico como "bactérias do ácido glutâmico" sendo organismos importantes na produção de aminoácidos. Durante a última década registaram-se avanços importantes no conhecimento da biologia molecular destes organismos: clonaram-se e sequenciaram-se genes do metabolismo primário, determinaram-se sequências promotoras, estabeleceram-se procedimentos para transformação e desenvolveram-se vários tipos de vectores. Com o aparecimento da técnica de electroforese em campo eléctrico pulsado, tornou-se possível estudar a organização genómica da maioria das bactérias e de uma grande variedade de pequenos eucariotas. Neste estudo, analizou-se o genoma de B.lactofenlzenturlz ATCC 13869 por PFGE; devido à sua composição em bases, o genoma foi clivado num pequeno número de fragmentos pelas enzimas de restrição S1va1 e PacI, totalizando a soma deles um valor de 3 .megapares de bases. Outras estirpes do designado grupo."do ácido glutâmico" foram também ojecto de análise: o número e a distribuição dos fragmentos obtidos foi muito semelhante. Brevibacterizml linens apresentou um comportamento diferente: o genoma desta estirpe não é clivado por PacI e S~ilaIo; btem-se um valor de 3.5 mpb para a dimensão do genoma, a partir dos fragmentos obtidos por digestão com as enzimas AseI, Dra1.e PrileI. Estes dados corroboram dados de outros autores que indicam que as estirpes classificadas como B.lactofe~ientzml estão mais relacionadas com estirpes do género Corynebacterizrm que com estirpes do género Brevibacterizrn2 . -, Construiu-se um banco de genes de B.lactofernzentzrín ATCC 13869 em cosmídeos, o qual constitui uma ferramenta util para o estudo da organização genómica. A partir deste banco de genes, clonaram-se elementos repetidos do genoma: DNA codificando para rRNA 16s e um elemento tipo 1s. Ambos os elementos foram sequenciados. O DNA de tipo IS caracterizou-se pela existência de uma presumível transposase localizada entre duas sequências invertidas terminais. A presumível transposase revelou alto grau de identidade com outras transposases quer de organismos gram-positivos, quer de gram-negativos. Foram também desenvolvidas estratégias para a construção futura de um mapa físico e genético de B.lactofeímentun~ e estirpes relacionadas. Localizaram-se vários marcadores genéticos sobre bandas PacI e SwaI e estabeleceram-se grupos de ligação.

Brevibacterium Iactofemzentunz strain ATCC 13869 is a member of the corynebacterial group. This strain and others closely related like Corynebacterizrm glutamicum ATCC 13032, are commonly referred as "glutarnic acid bacteria" and are relevant organisms on amino acid production. Studies on the molecular biology of this group of organisms have registered several advances on the last decade: genes from primary metabolism were cloned and sequenced, promoter sequences were identified, procedures for transformation were well established and different types of vectors were constructed. With the advent of pulsed-field gel electrophoresis, genetic studies on the overall organization of the genomes were made possible for most bacteria and a wide variety of small eucariotes. In this study, the genomic DNA of B.lactofem?entzmz ATCC 13869 was analyzed by PFGE; due to its base composition, the genome was cleaved in a small number of fragments by restriction enzimes PacI and SwaI, summing up to 3 megabase pairs. Other strains of the so-called group "glutamic acid bacteria" were also analyzed: the size range and number of PacI and SwaI fragments obtained was very similar. Brevibacterizrm linens showed a different behaviour: its genome is not cleaved by PacI or SlvaI; a value of 3.5 mbp was obtained for this strain with restriction enzymes AseI, DraI and PmeI. This data corroborates other authors data indicating that strains classified as B.lactofemzentzim are more related to strains of genus Cotynebacterizm~ than to strains beloging to genus Brevibactetiznr2. A cosmid gene bank was constructed form strain ATCC 13869, constituing an useful tool for studing genome organization. From this gene bank, repetitive elements of the genome m were cloned: 16s rRNA encoding DNA and an IS-like element. Both elements were sequenced. The IS-like DNA was characterized by the presence of a putative transposase between two terminal inverted repeats. The putative transposase showed strong identity with other transposases from gram-positive and gram-negative bacteria. Strategies for the future construction of a physical and genetic map of B. lactofenn entz~in and related bacteria were implemented. Several genetic markers were assigned to PacI and SwaI bands and linkage groups were established.