Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10773/22711
Title: Desenvolvimento e validação de um método analítico para a quantificação de GHB-GLUC e de GABA em sangue com fins forenses
Author: Dias, Ana Sofia Santos
Advisor: Domingues, Pedro Miguel Dimas Neves
Tarelho, Sónia
Castro, André Alexandre Lobo Lopes de
Keywords: Bioquímica clínica
Toxicologia forense
Sangue - Análise química
Metabolitos
Espectrometria de massa
Defense Date: 20-Dec-2017
Publisher: Universidade de Aveiro
Abstract: O ácido γ-hidroxibutírico (GHB) é um composto endógeno, sendo simultaneamente metabolito e precursor do neurotransmissor ácido γ-aminobutírico (GABA). O GHB está incluído no panorama de substâncias ilícitas disponíveis com fins psicoativos. Os contextos de utilização ilícita são maioritariamente caracterizados por fins recreativos ou como substância facilitadora de crime de abuso sexual, entre outros. A curta janela de deteção do GHB levanta algumas dificuldades. Neste sentido, a recente descoberta do metabolito glucuronizado do GHB (GHB-GLUC) levantou uma possibilidade de aumento da janela de deteção do GHB. Por outro lado, o estudo do comportamento post-mortem do GHB e, também, do GABA, despertou o interesse a fim de contribuir para uma estimação do intervalo post-mortem (PMI). Assim, é emergente a necessidade de colmatar as dificuldades referidas. Nesse sentido, são objetivos deste trabalho o estudo das vias de fragmentação dos compostos GHB-GLUC e GABA, após ionização por impacto eletrónico, em GC-MS/MS, para posterior validação de um método analítico para a quantificação simultânea do GHB-GLUC e do GABA, aliado ainda à quantificação de GHB, em amostras reais de sangue total. Através do estudo dos mecanismos de fragmentação mais prováveis, foi possível escolher, de forma sustentada, os iões precursores e iões produto considerados mais favoráveis para posterior deteção e quantificação do GHB-GLUC e do GABA. Relativamente à validação do método para o GHB-GLUC, a metodologia extrativa escolhida foi a precipitação proteica com metanol. Para a validação do método analítico estudaram-se diversos parâmetros: a especificidade/seletividade, a linearidade, os limites de deteção e de quantificação, a precisão, a exatidão, a recuperação e a robustez do método. Relativamente ao GABA, não se obtiveram resultados reprodutíveis para este composto, tendo-se verificado, ainda, instabilidade das soluções após derivatização. A metodologia analítica desenvolvida cumpriu todos os critérios de validação exigidos, o que permitiu a aplicação da mesma a um conjunto de amostras reais: uma amostra de soro positiva para GHB e uma série de amostras de sangue periférico post-mortem¸ nas quais se conhece a data e hora do óbito e a data e hora de cada uma das duas colheitas realizadas (uma no momento da admissão do cadáver e outra na autópsia). Foi possível detetar e quantificar GHB-GLUC na amostra positiva para GHB, tendo-se verificado, pela primeira vez na literatura, uma relação entre um contexto de intoxicação por GHB e a presença de GHB-GLUC. No que diz respeito à série de amostras post-mortem analisadas, em nenhuma das amostras se verificou a presença de GHB-GLUC. Estes resultados permitem levantar questões relativas à real importância desta via de metabolização do GHB, nomeadamente no post-mortem. Quanto ao GHB, verificou-se uma diferença estatisticamente significativa entre as concentrações médias do metabolito na primeira e na segunda colheitas. Tendo-se, ainda, verificado uma correlação positiva forte (r=0,902) entre as concentrações de GHB post-mortem e o respetivo PMI na primeira colheita (ou seja, até às 10 horas de PMI). Concluindo, este estudo forneceu dados relevantes para o potencial da análise do GHB-GLUC em casos de suspeita de consumo exógeno de GHB. Adicionalmente, os resultados obtidos neste estudo sugerem que existe uma maior correlação entre o PMI e a concentração de GHB, nas primeiras 10 horas após a morte.
γ-hydroxybutyrate (GHB) is an endogenous compound, simultaneously metabolite and precursor of the neurotransmitter γ-aminobutyric acid (GABA). GHB is included in the panel of illicit substances available for psychoactive purposes. Its illicit use may be due to recreational purposes or drug-facilitated sexual assault, among other contexts. The short GHB detection window raises some difficulties. Thus, the recent discovery of a glucuronated GHB metabolite (GHB-GLUC), raised the possibility of increasing the window of detection of GHB. On the other hand, post-mortem behaviour of GHB and GABA has been studied to assist in PMI estimation. As so, overcome the mentioned issues is needed. The aim of this work considers the study of GHB-GLUC and GABA fragmentation pathways after electron impact ionization in GC-MS/MS, an analytical method development and validation for the simultaneous quantification of GHB-GLUC and GABA, allied to the quantification of the GHB, in order to be applied to real blood samples. Through the study of the most probable fragmentation mechanisms, it was possible to choose, in a sustained way, the precursor and product ions considered more favourable for further detection and quantification of GHB-GLUC and GABA. Regarding the analytical method validation, as to GHB-GLUC is concerned, the chosen extractive methodology was protein precipitation with methanol. For the validation of the analytical method, several parameters were studied, including specificity/selectivity, linearity, limits of detection and quantification, precision, accuracy, recovery and ruggedness. Regarding GABA, it was not possible to perform the validation, since no reproducible results were obtained. The developed and validated analytical procedure have shown acceptable results, and allowed its application to a set of real samples, namely a serum sample positive for GHB and a series of samples of post-mortem peripheral blood in which both the date and hour of death are known, alongside the date and hour of the two sampling moments (one in the corpse admission and another at the autopsy). It was possible to detect and quantify GHB-GLUC in the GHB positive sample and, for the first time in the literature, an association between the exogenous consumption of GHB and GHB-GLUC presence was found. Regarding the series of analysed post-mortem samples, none of them shown GHB-GLUC presence. These results allow us to raise questions about the real importance of this GHB metabolism pathway, particularly in post-mortem context. Concerning to GHB, there was a statistically significant difference between the mean concentrations of the metabolite in the first and the second collection. There was also a strong positive correlation (r=0,902) between the post-mortem GHB concentrations and the respective PMI in the first collection (up to 10 hours of PMI). In conclusion, this study provided relevant data to the potential of GHB-GLUC analysis in cases of suspected exogenous consumption of GHB. Furthermore, the obtained results suggest that, in the first 10 hours after death there is a higher correlation between the GHB concentration and the PMI.
Description: Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica
URI: http://hdl.handle.net/10773/22711
Appears in Collections:DQ - Dissertações de mestrado
UA - Dissertações de mestrado

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