Metabolitos alvo da urina com potencial impacto na compreensão da asma

Abstract

A asma é uma doença inflamatória, crónica e heterogénea, das vias respiratórias, com elevado impato socioeconómico e crescente incidência e prevalência. O principal objetivo desta tese foi a implementação de uma metodologia que permita a análise simultânea do perfil metabólico urinário de famílias químicas com potencial relevância na compreensão da asma, nomeadamente aminoácidos, ácidos orgânicos, ácidos gordos e açúcares. Primeiramente procedeu-se à implementação da metodologia, testando diferentes condições de sililação, seguido de análise por GC-qMS (cromatografia em fase gasosa - espectrometria de massa com quadrupolo). Foram analisadas amostras de urina recolhidas em contexto hospitalar, incluindo 37 indivíduos asmáticos, 19 com diversas alergias e 17 saudáveis, usados como controlo. O grupo de indivíduos com asma e alergias era constituído por 34 mulheres e 22 homens, dos 3 os 79 anos de idade, e em que 59% tomava medicação e 36% tinha co-patologias associadas. Inicialmente, as amostras de urina foram caracterizadas relativamente à condutividade e teor de creatinina. Verificou-se uma grande dispersão dos resultados dentro de cada grupo, com valor mediano de 11±6 mS/cm nos controlos e 17±4 mS/cm nos indivíduos asmáticos para a condutividade, e 612±195 μg/mL nos controlos e 842±211 μg/mL nos indivíduos asmáticos para a creatinina, demonstrando que ambos os parâmetros são estatisticamente diferentes entre grupos. De seguida, foram identificados 35 metabolitos pertencentes às famílias químicas alvo: 4 aminoácidos, 6 ácidos orgânicos, 2 ácidos gordos e 23 açúcares. Com o objetivo de comparar diferentes abordagens de normalização, as concentrações dos metabolitos (expressas em equivalentes de padrão interno) foram normalizadas pelos respetivos valores de condutividade e teor de creatinina. No entanto, estas abordagens não permitiram incrementar o número de metabolitos diferenciadores entre os grupos. Assim, a concentração dos metabolitos alvo, expressa em equivalentes de padrão interno, foi a estratégia selecionada para uma melhor identificação de alterações estatisticamente significativas entre os grupos objeto de estudo. Efetuou-se uma análise estatística a uma matriz que incluiu todas as idades (3 aos 79 anos), tendo-se observado significância estatística em 19 metabolitos (3 aminoácidos, 6 ácidos orgânicos e 10 açúcares). Para minimizar a influência de potenciais fatores de confusão, nomeadamente a idade, realizou-se um estudo focado nos indivíduos de 10 a 30 anos (19 mulheres e 16 homens, 59% tomava medicação e 20% tinha co-patologias). Ao estudar uma população alvo menor, a distinção entre as amostras aumentou, sendo que se obtiveram 28 metabolitos (4 aminoácidos, 6 ácidos orgânicos, 2 ácidos gordos e 16 açúcares) estatisticamente diferentes entre os grupos objeto de estudo. Assim, mais 9 metabolitos (L-5-oxoprolina, ácido hexadecanóico, ácido octadecanóico, treitol, ribose, frutose, manitol, sorbose e galactose) permitem fazer a distinção entre os grupos. Apesar da dispersão observada nos valores dentro de cada grupo, que pode ser explicada pela heterogeneidade da doença, nomeadamente a existência de vários fenótipos e endótipos dentro da asma, foi possível identificar um conjunto de metabolitos nos quais se observaram diferenças estatisticamente significativas. Estes metabolitos estão associados a fenómenos de stress oxidativo, relacionando o metabolismo dos aminoácidos, metabolismo lipídico, metabolismo energético e metabolismo dos hidratos de carbono de forma integrada.

Asthma is an inflammatory, chronic and heterogeneous, disorder of the respiratory pathways, with high socioeconomic impact and growing incidence and prevalence. The main objective of this master thesis was the implementation of a methodology that allows the simultaneous study of the urinary metabolic profile of chemical families with potential relevance in the understanding of asthma, namely amino acids, organic acid, fatty acids and sugars. Firstly, we implemented the methodology, testing different silylation conditions, followed by GC-qMS analysis (gas chromatography - mass spectrometry with quadrupole). Were analysed urine specimens, collected in hospital context, which included a group of 37 asthmatic subjects, 19 individuals with various allergies and 17 healthy subjects, used as control. Asthma and allergies group was consisted by 34 women and 22 men, from 3 to 79 years old, in which 59% took medication and 36% had associated co-pathologies. Initially, urine samples were characterized for conductivity and creatinine content. There was a large dispersion of the results within each group, with a median value of 11±6 mS/cm in the controls and 17±4 mS/cm in the asthmatic individuals for conductivity, and 612±195 μg/mL in the controls and 842±211 μg/mL in the asthmatic individuals for creatinine, showing that both parameters are statistically different between groups. Then, 35 metabolites belonging to target families were identified: 4 amino acids, 6 organic acids, 2 fatty acids and 23 sugars. In order to compare different normalization approaches, the concentrations of metabolites, expressed as equivalent of internal standard were normalized by their respective values of conductivity and creatinine content. However, these approaches didn´t allow to increase the number of differentiating metabolites between the groups. Thus, the concentration of the target metabolites, expressed as equivalent of internal standard, was the strategy selected for a better identification of statistically significant changes among the groups under study. A statistical analysis was performed to a matrix that included all ages (3 to 79 years) where it was observed statistical significance in 19 metabolites (3 amino acids, 6 organic acids and 10 sugars). In order to minimize the influence of potential confounding factors, namely age, a study focused on individuals aged 10 to 30 years (19 women and 16 men, 59% taking medication and 20% pathologies). By studying a smaller target population, the distinction between the samples increased, and we obtained 28 metabolites (4 amino acids, 6 organic acids, 2 fatty acids and 16 sugars) statistically different among the study groups. Thus, a further 9 metabolites (L-5-oxoproline, hexadecanoic acid, octadecanoic acid, treitol, ribose, fructose, mannitol, sorbose and galactose) allow to distinguish between groups. Despite the dispersion observed in the values within each group, which can be explained by the disease heterogeneity, namely the existence of several phenotypes and endotypes within the asthma, it was possible to identify a set of metabolites in which statistically significant differences were observed. These metabolites were associated to oxidative stress phenomena, relating amino acid metabolism, lipid metabolism, energy metabolism and carbohydrate metabolism in an integrated way