Detection of C-reactive protein using functionalized gold nanoparticles

Abstract

Este projeto teve como objetivo desenvolver novas estratégias para funcionalizar nanopartículas de ouro (Au NPs) de forma a detetar a proteína C-reativa (CRP). Assim, foram sintetizadas nanopartículas de ouro esféricas com tamanhos médios de aproximadamente 10 e 40 nm. Posteriormente, a superfície das Au NPs foi modificada utilizando duas abordagens diferentes. Na primeira abordagem as Au NPs estabilizadas com citrato foram funcionalizadas com grupos ácidos carboxílicos pela modificação da superfície com os ligandos: ácido 11-mercaptoundecanóico (MUDA) e ácido mercaptopropiónico (MPA). Posteriormente a citidina difosfocolina (CDP) foi acoplada covalentemente à superfície das Au NPs utilizando 1-etil-3-(3’- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) para promover a reação. Na segunda abordagem as Au NPs estabilizadas com citrato foram modificadas com um aptâmero específico para a CRP. Estes materiais foram caracterizados utilizando diversas técnicas de análise nomeadamente espectroscopia de UVvis e de infravermelho (FTIR), medidas de potencial Zeta e de diâmetro hidrodinâmico e microscopia eletrónica de transmissão (TEM). Amostras selecionadas de Au NPs modificadas com aptâmero (Au NPs@ssDNA+NaCl+KCl) e de Au NPs bioconjugadas com CDP (Au NPs@MUDA@CDP_40nm e Au NPs@MPA@CDP_10nm) foram utilizadas para o estudo da deteção da proteína: CRP. As Au NPs foram adicionadas a soluções de concentração conhecida (10 - 100 nM). A deteção da CRP foi investigada através da aquisição de espectros de UV-vis. O aumento da razão de agregação, isto é entre a absorvância a 620 nm e a absorvância da banda de ressonância de plasmão de superfície localizada (A620/ALSPR), foi monitorizada ao longo do tempo, indiciando a deteção da CRP para todas as amostras testadas. Para os sistemas Au NPs@MUDA@CDP_40nm e Au NPs@ssDNA+NaCl+KCl foi possível correlacionar a razão A620/ALSPR com a concentração da CRP através de uma relação linear nas gamas de concentração de 20 - 50 nM (R2=0.9425) e de, 20 - 45 nM (R2=0.9382) respetivamente. Os resultados obtidos, embora preliminares, são promissores sendo necessário avaliar em estudos futuros aspetos tais como reprodutibilidade e interferência de outras proteínas em estudos futuros, tendo em vista o desenvolvimento de biossensores válidos para a deteção de CRP

The main goal of this project was to develop novel strategies for the functionalization of gold nanoparticles (Au NPs) aiming the detection of Creactive protein (CRP). Au NPs with an average size of 10 and 40 nm were synthesized. Then, the surface of Au NPs was modified following two different approaches. The first approach consisted on the surface functionalization of citrate stabilized Au NPs with carboxylic acid groups, by surface modification using 11-mercaptoundecanoic acid (MUDA) and mercaptopropionic acid (MPA). The cytidine diphosphocholine (CDP) was covalently attached to the surface of functionalized Au NPs using 1-(3-dimethylaminopropyl)-3- ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) to promote the coupling reaction. In the second approach, citrate stabilized Au NPs were modified with a CRP specific aptamer. These materials were characterized using several analysis techniques namely UV-vis spectroscopy, infra-red spectroscopy (F-T IR), zeta potential and hydrodynamic diameter measurements and transmission electron microscopy (TEM). Selected samples of Au NPs modified with aptamer (Au NPs@ssDNA+NaCl+KCl) and CDP bioconjugated Au NPs (Au NPs@MUDA@CDP_40nm e Au NPS@MPA@CDP_10nm) were used for studying CRP detection. Au NPs samples were added to CRP solutions of known concentration (10-100 nM). The detection was measured through acquisition of the UV-vis spectra. The increase of aggregation ratio between absorbance at 620 nm and the absorbance of localized surface plasmon resonance band (A620/ALSPR) was monitored along time and, indicated that CRP was detected for all the Au NPs samples tested. For the systems Au NPs@MUDA@CDP_40nm and Au NPs@ssDNA+NaCl+KCl it was possible to find a linear correlation between the ratio A620/ALSPR and the CRP concentration, within the concentration range 20 - 50 nM (R2=0.9425) and, 20 - 45 nM (R2=0.9382), respectively. The results obtained are very promising but still preliminary. Further studies are needed to evaluate key aspects such as reproducibility and interference of other proteins, keeping as main objective the development of valid biosensors for CRP detection.