Product of Biomode based in the PNA-FISH technology for the detection of Aspergillus fumigatus in the clinical area

Abstract

A Biomode está a desenvolver um kit de diagnóstico baseado na tecnologia de hibridação fluorescente in situ (FISH) de ácido nucleico peptídico (PNA) (PNAFISH) para a deteção de Aspergillus fumigatus em amostras pulmonares. O fungo A. fumigatus é o principal agente patogénico responsável pela aspergilose pulmonar invasiva. Os indivíduos imunocomprometidos têm mais tendência para desenvolver esta patologia devido a uma diminuição da capacidade defensora do sistema imunológico. Atualmente, os métodos de diagnóstico que existem para a deteção de aspergilose pulmonar invasiva são: o exame micológico convencional (observação direta ao microscópio, observação histológica e cultura); exames de imagiologia; testes imunológicos para a deteção do galactomanano, do β(1,3)-glucano e de uma glicoproteína extracelular e testes moleculares baseados na reação em cadeia da polimerase (PCR). Neste estudo, um dos objetivos era otimizar o passo de enriquecimento em culturas puras e amostras pré-preparadas contaminadas artificialmente (sangue de cavalo desfibrinado e meio de expetoração artificial (ASM)). Outro objetivo era realizar testes que serão incluídos no ficheiro técnico do produto final, tal como, a reprodutibilidade e a repetibilidade. O objetivo final era realizar um teste de validação para avaliar o desempenho do método PNA-FISH em amostras reais. Inicialmente, a germinação do A. fumigatus foi avaliada em três caldos de meio de crescimento diferentes (peptona - extrato de levedura - glucose (PYG), caldo sabouraud dextrose (SDB) e caldo batata dextrose (PDB)) durante 3 h, 4 h, 6 h e 8 h. Os melhores resultados foram obtidos com o meio PDB, tendo sido este o meio selecionado para usar nos ensaios seguintes. Um bom sinal fluorescente foi conseguido a partir das 4 h no sangue de cavalo desfibrinado e a partir das 8 h na ASM. Valores ótimos de reprodutibilidade e repetibilidade foram alcançados (100%). O método de PNA-FISH foi avaliado em amostras clínicas reais (expetoração, lavado broncoalveolar (BAL) e lavado brônquico (BL)) recolhidas a partir de pacientes do Centro Hospitalar do Médio Ave (CHMA). Vinte e quatro amostras foram submetidas ao método de PNA-FISH, usando 8 h de germinação, e estes resultados foram comparados com os resultados do método de cultura. Todas as amostras testadas foram negativas para o A. fumigatus usando o PNA-FISH. No entanto, três amostras foram positivas para o A. fumigatus usando o método de cultura. A menor concentração de A. fumigatus que proporcionou um resultado positivo de PNA-FISH foi 1×104 conídios/mL para a expetoração e 1×103 conídios/mL para as amostras BAL e BL. Um ensaio preliminar foi feito para avaliar o desempenho do PNA-FISH em nove amostras inoculadas com as concentrações mínimas pré-determinadas, durante 8 h de germinação. Às 8 h, os resultados não foram bons e o tempo de enriquecimento foi prolongado para 12 h e 24 h. Os melhores resultados foram obtidos às 24 h. No final, no teste de validação cego obteve-se uma especificidade relativa de 100% e uma sensibilidade relativa de 50%, 75% e 77% para tempos de enriquecimento de 8 h, 12 h e 24 h, respetivamente. Os resultados obtidos neste estudo mostraram que o método de PNA-FISH pode ser uma boa alternativa para detectar o A. fumigatus.

Biomode is developing a diagnostic kit based on fluorescence in situ hybridization (FISH) of peptide nucleic acid (PNA) (PNA-FISH) technology for the detection of Aspergillus fumigatus in pulmonary samples. The fungus A. fumigatus is the main pathogen agent responsible for invasive pulmonary aspergillosis. Immunocompromised patients are more likely to develop this pathology due to a decrease in the immune system’s defender capacity. Currently, the diagnostic methods that exist for the detection of invasive pulmonary aspergillosis are: conventional mycological examination (direct observation under the microscope, histopathologic observation and culture); imagiological examinations; immunological tests for the detection of galactomannan, β(1,3)-glucan and an extracellular glycoprotein and molecular tests based on polymerase chain reaction (PCR). In this study, one of the aims was to optimise the enrichment step in pure cultures and artificially contaminated pre-prepared samples (defibrinated horse blood and artificial sputum medium (ASM)). Another aim was to perform tests to be included in the final product technical file, such as, reproducibility and repeatability. The final aim was to perform a validation test to evaluate the PNA-FISH method performance in real samples. Initially, the A. fumigatus germination was evaluated in three different liquid growth media (peptone - yeast extract - glucose (PYG), sabouraud dextrose broth (SDB) and potato dextrose broth (PDB)) for 3 h, 4 h, 6 h and 8 h. The best results were obtained with PDB medium and this medium was the selected for use in the subsequent assays. A good fluorescent signal was achieved from 4 h in defibrinated horse blood and from 8 h in ASM. Reproducibility and repeatability optimal values was achieved (100%). The PNA-FISH method performance was evaluated in real clinical samples (sputum, bronchoalveolar lavage (BAL) and bronchial lavage (BL)) collected from patients from Centro Hospitalar do Médio Ave (CHMA). Twenty-four samples were submitted to PNA-FISH method, using 8 h of germination, and these results were compared with the culture method results. All the samples tested were negative for A. fumigatus using the PNA-FISH. However, three samples were positive for A. fumigatus using the culture method. The lowest A. fumigatus concentration delivering a positive PNA-FISH result was 1×104 conidia/mL for sputum and 1×103 conidia/mL for BAL and BL samples. A preliminary assay was done to evaluate the PNA-FISH performance in nine samples inoculated with the pre-determined minimum concentrations, for 8 h of germination. At 8 h, the results were not good and the enrichment time was extended to 12 h and 24 h. The best results were obtained at 24 h. In the final, in the blind validation test was obtained a relative specificity of 100% and a relative sensitivity of 50%, 75% and 77% for enrichment times of 8 h, 12 h and 24 h, respectively. The results obtained in this study showed that PNA-FISH method may be a good alternative to detect the A. fumigatus.