Protective effects of seaweed feed supplementation towards genetic integrity in gilthead seabream (Sparus aurata)

Abstract

The DNA integrity and stability are essential to organisms’ health, fitness and, ultimately, to survival. This matter has been neglected in what concerns to fish in aquaculture systems, disregarding the potential impacts of both endogenous and exogenous factors. The manipulation of rearing conditions to achieve a fast-growing performance, as well as the occurrence (intentional or accidental) of agents/conditions, such as disinfectants, anesthetics, antibiotics and waterborne contaminants, may create stressful conditions passible to affect DNA integrity. Furthermore, in the long-term, this situation may compromise growth performance, animal welfare and a reduction in revenues. Seaweeds are a potential source of natural and high value compounds, with a large spectrum of biological activities and health benefits. It has been suggested that algae-enriched diet improves the growth, lipid metabolism, physiological activity, and disease resistance of various fish species; however, its anti-genotoxic potential was scarcely evaluated. Hence, this study aimed to evaluate the anti-genotoxic properties of a macroalgae-enriched diet to provide protection in gilthead seabream (Sparus aurata) against a genotoxic challenge (i.p. injection of 40 mg.kg-1 cyclophosphamide - CP), as well as to clarify if the potentially favorable effects of algae persist beyond the end of supplementation. The enriched diet was supplemented with 5% of equal parts of three species: Ulva spp. (Chlorophyta), Fucus spp. (Phaeophyta) and Gracilaria spp. (Rhodophyta). Thus, two groups of fish were differently fed during the first 30 days, until the CP injection, where they were separated depending on the diet/stimulus. Subsequently, in order to clarify the protective effect of the supplemented diet, 3 days after injection, half of each group previously fed with this diet has changed to the standard feed, keeping all the other groups the same way, for another 7 days. Genetic damage was evaluated through the erythrocytic nuclear abnormalities (ENA) and comet assays and the involvement of the antioxidant system as indication of a pro-oxidant status was assessed by superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione-S-transferase (GST), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities, as well as by total glutathione (GSHt) content. The elucidation of the oxidative DNA damage-protecting activity was made by adopting as diagnostic tool the comet assay improved with DNA lesion-specific enzymes, FPG and Endo III, which convert oxidized purines and pyrimidines into extra DNA single strand breaks, respectively. The results pointed that algae-enriched feed exhibits anti-genotoxic properties in gilthead seabream blood cells, evident in relation to DNA strand breaks and to chromosomal lesions, though it appeared more pronounced in the latter type of genotoxicity expression. This effect was depicted by fish sampled at the last sampling moment, since a significant recovery of chromosomal damage was evident in fish previously injected with CP. A clear oxidative DNA damage–protecting activity was displayed, particularly in the presence of a strong genotoxic insult occurring three days after CP injection, when purine oxidation was prevented by algae supplementation. Nonetheless, blood antioxidants were not altered by the supplemented diet, with the exception of GST activity that was induced as response to CP treatment. Considering the persistence of favorable effects, 7 days without algae uptake was enough to partially reduce the protection efficacy, mainly in what concerns to the oxidative DNA damage-protecting capacity. Overall, these results seem to be promising towards the benefits of seaweed inclusion in fish diet, offering a potential strategy to strengthen fish fitness, and thus, to invigorate aquaculture activity, also providing new insights on the mechanisms of DNA protection in fish.

A integridade e estabilidade do ADN são essenciais para a saúde e condição fisiológica geral dos organismos e, em última instância, para a sua sobrevivência. Este tema tem sido negligenciado no que diz respeito a peixes em sistemas de aquacultura, descurando os potenciais impactos de fatores endógenos e exógenos. A manipulação das condições de cultivo para alcançar um crescimento rápido, assim como a ocorrência (intencional ou acidental) de agentes/condições tais como desinfetantes, anestésicos, antibióticos e contaminação aquática podem criar estados de stresse passíveis de afetar a integridade do ADN. Além disso, a longo prazo, esta situação pode comprometer o desempenho do crescimento, o bem-estar animal e reduzir as receitas. As macroalgas marinhas são uma fonte potencial de compostos naturais de elevado valor, com um amplo espectro de atividades biológicas e benefícios para a saúde. Tem sido sugerido que uma dieta enriquecida com algas melhora o crescimento, metabolismo dos lípidos, atividade fisiológica e a resistência a doenças de várias espécies de peixes. No entanto, o seu potencial anti-genotóxico permanece por explorar. Assim, este estudo teve como objetivo central avaliar as propriedades anti-genotóxicas de uma ração enriquecida com macroalgas, em dourada (Sparus aurata), após um desafio genotóxico (injeção intraperitoneal de 40 mg.kg-1 de ciclofosfamida - CP). A ração enriquecida foi suplementada com um total de 5% de algas, incorporando três espécies em partes iguais: Ulva spp. (Chlorophyta), Fucus spp. (Phaeophyta) e Gracilaria spp. (Rhodophyta). Deste modo, dois grupos de peixes foram alimentados de forma diferenciada nos primeiros 30 dias, até ao momento da injeção, onde foram separados consoante a dieta/estímulo. Posteriormente, de modo a esclarecer o efeito protetor da ração enriquecida, 3 dias após a injeção, metade de cada grupo previamente alimentado com esta dieta viu a sua alimentação alterada para a ração padrão, mantendo-se todos os outros grupos iguais, durante mais 7 dias. Foi avaliado o dano genético através dos ensaios do cometa e de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE), em paralelo com o estudo do envolvimento do sistema antioxidante, como indicação de um estado pró-oxidante, determinando as atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa-S-transferase (GST), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), bem como o teor total de glutationa (GSHt). A elucidação do dano oxidativo de ADN foi feita através do ensaio do cometa melhorado pela incubação com enzimas específicas de reparação de ADN, FPG e Endo III, que convertem purinas e pirimidinas oxidadas em ruturas extra de cadeia única, respetivamente. Os resultados demonstraram que a alimentação enriquecida com algas apresenta propriedades anti-genotóxicas em células sanguíneas de dourada, evidentes em relação às quebras de cadeias de ADN e a lesões cromossómicas, embora pareça mais pronunciada no último tipo de expressão genotóxica. Esse efeito foi particularmente notório no último momento de amostragem, uma vez que foi conseguida uma completa recuperação do dano cromossómico em peixes previamente injetados com CP. Foi ainda evidenciada uma clara atividade de proteção contra o dano oxidativo do ADN, particularmente na presença de um forte insulto genotóxico ocorrido três dias após a injeção de CP, o que foi expresso no impedimento da oxidação de bases purínica pela suplementação de algas. No entanto, os antioxidantes não foram alterados pela dieta suplementada, com exceção da atividade da GST que foi induzida como resposta ao tratamento de CP. Considerando a persistência de efeitos favoráveis, 7 dias após a remoção de algas da dieta foram suficientes para reduzir parcialmente a eficácia da proteção, principalmente no que diz respeito à capacidade de contrariar o dano oxidativo de ADN. Globalmente, estes resultados são promissores quanto à identificação dos benefícios da inclusão de algas na dieta de peixe, oferecendo uma estratégia potencial para fortalecer a condição dos peixes e, assim, revigorar a atividade aquícola, fornecendo também novos conhecimentos sobre os mecanismos de proteção do ADN em peixes.