Marcadores Genotóxicos em Animais de Vida Aquática

Abstract

O presente trabalho incidiu sobre estudo do efeito de contaminantes ambientais na enguia europeia (Anguilla anguilla L.) e em robalo (Dicentrarchus labrax L.). Estas espécies foram escolhidas como modelos biológicos, uma vez que são representativas da ictiofauna da Ria de Aveiro. O efeito mutagénico de compostos modelo tais como o hidrocarboneto aromático policíclico (HAP) benzo(a)pireno (BaP), e de um flavonóide sintético – a ?-naftoflavona (BNF), foi posta em evidência, recorrendo ao teste de Ames na presença da fracção pós - mitocondrial (S9) de enguia. Os efeitos genotóxicos ao nível sanguíneo, hepático, e renal foram também investigados, assim como as respostas das Fase I e II da biotransformação hepática induzidas por: i) BaP; ii) naftaleno; iii) águas contaminadas pela actividade portuária; iv) fracção hidrossolúvel de um efluente previamente tratado com lamas activadas (T); v) ácidos resínicos (ARs) como ácido abiético (AA) e ácido desidroabiético (ADA); vi) reteno (HAP substituído); vii) efluente diluído da indústria da pasta de papel (E25 e E50); viii) fracção hidrossolúvel de sedimento contaminado por efluente da indústria de pasta de papel (S); ix) águas contaminadas por efluente da indústria de pasta de papel; x) BNF. A avaliação dos efeitos dos diferentes contaminantes ambientais foi realizada com base nos seguintes parâmetros biológicos: 1) avaliação da integridade do ADN hepático e sanguíneo, frequência de anomalias nucleares eritrocíticas (ANE) e frequência de micronúcleos eritrocíticos (MNE), como indicadores de genotoxicidade; 2) actividade da etoxiresorufina O-desetilase (EROD) e conteúdo total em citocromo P450 hepáticos, como indicadores de activação da Fase I da biotransformação e actividade da glutationa S-transferase (GST) como indicador de activação da Fase II; 3) actividade alanina aminotransferase (ALT) hepática, como indicador de lesões hepáticas; 4) número de eritrócitos (NE), concentração de hemoglobina (Hb) e razão Hb/NE, como indicadores hematológicos. A fracção S9 de enguia demonstrou a sua capacidade para biotransformar elevadas concentrações de BaP em compostos mutagénicos, com e sem prévia indução do S9 por BNF. Contudo, as baixas concentrações de BaP apenas promoveram mutagenicidade, após a indução prévia por BNF da fracção S9 hepática da enguia. A exposição de enguias a BaP resultou no decréscimo da integridade do ADN hepático e sanguíneo; sendo o ADN sanguíneo, afectado mais cedo pelas concentrações mais elevadas de BaP. O aumento de ANE foi detectado mais tardiamente do que as quebras na cadeia do ADN. A actividade EROD hepática foi induzida pelo BaP, para todas as condições de exposição. A exposição de enguias in situ a águas portuárias demonstrou efeito genotóxico, conduzindo à diminuição da integridade do ADN sanguíneo, hepático e renal. Apesar da presença confirmada de HAPs, não se encontraram alterações significativas de ANEs e de EROD hepática. Contudo, este tipo de exposição aumentou o conteúdo em P450 total. A integridade do ADN hepático e sanguíneo diminuiu, após exposição das enguias ao AA. No entanto a integridade do ADN hepático foi afectado mais cedo. A concentração mais elevada de AA induziu um aumento significativo de ANE. Os valores de Hb/NE decresceram nas enguias expostas às concentrações mais elevadas de AA. A actividade de EROD aumentou pontualmente para a concentração mais elevada de AA. A actividade de GST hepática aumentou para as concentrações de AA mais baixas. A exposição a ADA, traduziu-se numa descida da integridade do ADN hepático e sanguíneo, não se observando porém qualquer efeito genotóxico no sangue para a concentração mais baixa de ADA. O aumento de ANEs verificou-se para todas as concentrações de ADA, sendo no entanto pontual para as concentrações mais baixas e mais elevada. A razão Hb/NE aumentou após exposição ao ADA. O ADA induziu a actividade de EROD hepática das enguias, verificando-se no entanto, a inibição dessa actividade para a exposição mais prolongada à concentração mais elevada de ADA. O conteúdo em P450 total aumentou após exposição ao ADA. A actividade de GST hepática aumentou para todas as concentrações testadas, exceptuando a mais baixa concentração de ADA. A genotoxicidade do reteno em enguias manifestou-se através de um decréscimo na integridade do ADN, sendo mais acentuada no fígado do que no sangue. O aumento de ANE foi detectado, incluindo zonas nucleares com ausência de ADN (ANE+Not). A exposição a reteno resultou ainda na subida da razão Hb/NE, na indução da actividade EROD hepática e no aumento do conteúdo em P450 para exposições às concentrações mais elevadas testadas. Em enguias expostas a BNF, os efeitos genotóxicos traduziram-se na descida da integridade do ADN hepático e sanguíneo, sendo o fígado o primeiro órgão a revelar danos provocados por este xenobiótico. Robalos juvenis expostos a uma concentração elevada de BNF demonstraram uma associação entre o aumento da actividade de biotransformação, a diminuição na integridade do ADN hepático, bem como o aumento de ANE e MNE. Contudo, o aumento da actividade de EROD hepática não foi associado a efeitos de genotoxicidade, em enguias adultas expostas a uma concentração elevada de naftaleno, reteno e BNF. A exposição de enguias ao efluente diluído da indústria da pasta de papel (E25 e E50), induziu danos no ADN sanguíneo anteriormente à indução hepática. O aumento de ANEs foi também observado, apesar de pontualmente no que respeita ao efluente menos diluído, e dos sinais de citotoxicidade evidentes. A actividade de EROD hepática também foi induzida. A S foi fraca indutora de EROD hepática. Contudo S é responsável pelos baixos valores de integridade no ADN hepático e sanguíneo, bem como pela elevação na frequência de ANEs. A exposição a T também se revelou genotóxica em relação às enguias, promovendo pontualmente quebras na cadeia do ADN hepático e sanguíneo e ainda um aumento prolongado de ANEs. A actividade de GST hepática aumentou apenas no fim do período de exposição para as exposições E25 e E50 e S. Estudos de campo in situ demonstraram o efeito genotóxico de águas contaminadas por efluentes da indústria da pasta de papel. O aumento da frequência de ANEs a 100 e 2000 metros de distância da margem onde se localizava a saída desactivada do efluente; enquanto que a diminuição da integridade do ADN foi detectado a 100 metros para o fígado e sangue. O aumento da actividade EROD hepática foi detectado num local afastado 2000 metros da mesma saída desactivada do efluente. Os contaminantes ambientais investigados constituem um sério risco para as várias espécies de organismos aquáticos devido à grande variedade de efeitos adversos revelados. Desta forma, as populações aquáticas da Ria de Aveiro, assim como as zonas costeiras contaminadas pelo exutor submarino, poderão estar sujeitas a acções tóxicas exercidas a nível genético e /ou fisiológico que se poderão traduzir posteriormente ao nível da reprodução e sobrevivência. Os resultados experimentais sugerem a utilização de um conjunto de parâmetros que poderão constituir uma bateria de biomarcadores, abrangendo diversos níveis biológicos organizacionais e aplicáveis a diversas espécies e a diferentes desenhos experimentais.

The present research work concerns the effect of environmental contaminants upon the European eel (Anguilla anguilla L.) and the sea bass (Dicentrarchus labrax L.). These two species were chosen as biological models as they are representative of the Aveiro lagoon ichtiofauna. The mutagenic effect of a PAH model compound such as benzo[a]pyrene (B[a]P) and a synthetic flavonoid – ?-naphthoflavone – (BNF) a PAH-like compound was demonstrated by the Ames test using the eel’s post mitochondrial fraction (S9). Blood, liver and kidney genotoxic effects as well as Phase I and Phase II liver biotransformation induced responses were investigated after exposure to i) BaP; ii) naphthalene (NAPH); iii) Contaminated harbour waters (HW); iv) The water soluble fraction of the effluent previously treated by activated sludge (T); v) Resin acids such as abietic acid (AA) and dehydroabietic acid (DHAA); vi) retene (Re); vii) the diluted pulp mill effluent (E50 and E25); viii) the pulp mill effluent sediment water soluble fraction (S); ix) in situ River Vouga water contaminated by the pulp mill effluent; x) BNF. The environmental contamination effects were evaluated according to 1) liver, kidney and blood DNA integrity, erythrocytic nuclear anomalies (ENA) and erythrocytic micronuclei frequency as genotoxicity indicators; 2) liver cytochrome P450 and ethoxyresorufin O-deethylase (Phase I) (EROD) and glutathione- S – transferase (GST) (Phase II) as biotransformation induction; 3) liver alanine amino transferase (ALT) as hepatocyte lesion indicator; 4) red blood cells count per blood cubic mm (RBC); blood hemoglobin (Hb) and Hb/RBC as haematological indicators Anguilla anguilla L. liver S9 had the capacity to convert a promutagen such as BaP into a mutagenic compound. The eel’s liver S9 induced by BNF was required to convert very low concentrations of a promutagen such as BaP into a mutagenic compound. The eel’s exposure to BaP induced a decrease in blood and liver DNA integrity. Early blood DNA integrity decrease was found after exposure to high BaP concentrations. A delayed ENA frequency increase was observed compared to the blood DNA integrity decrease. Liver EROD activity increase was induced after exposure to all BaP concentrations during the whole exposure. The eel’s exposed in situ to the harbour waters have demonstrated a decrease in blood, liver and kidney DNA integrity. ENAs increased frequency and liver EROD activity induction were not observed despite the confirmed presence of PAHs in those HWs. However, liver P450 content was increased in eels under the previous conditions. The eel’s AA exposure induced a decrease in liver and blood DNA integrity decrease. However, an early DNA integrity decrease was observed in liver compared to blood. The eel’s highest AA exposure concentration induced a significant ENAs increase. The ratio Hb/RBC decreased in eels exposed to the highest AA concentrations. Liver EROD activity increased punctually after exposure to the highest AA concentration and GST activity increased after exposure to the lowest AA concentrations. Eels DHAA exposure decreased liver and blood DNA integrity. However, the lowest DHAA eels exposure concentration had no genotoxic effect on blood. ANEs increase was observed in all DHAA exposure concentrations, being however punctual for the lowest and highest concentrations. The ratio Hb/RBC increased significantly after exposure to DHAA. DHAA induced liver EROD activity in eels, despite its inhibition after long exposures to the highest concentration. Liver P450 content was also increased by the eel’s exposure to DHAA. GST activity increased in the eel’s liver exposed to all DHAA concentrations except to the lowest. Re genotoxicity was observed in eels as liver and blood DNA integrity decrease which is higher in liver than in blood. The ENAs increase was also observed, including the lack of DNA in some nuclear regions (ENA+Not). The eel’s exposure to the highest Re concentrations increased de ratio Hb/RBC, liver EROD activity and its P450 content. Adult eels exposed to the highest BNF concentration presented a liver and blood DNA integrity decrease. The eel’s liver revealed an early DNA integrity decrease compared to blood after exposure to the highest BNF exposure. Juvenile sea bass exposed to the highest BNF concentration revealed an increased liver EROD activity, a decreased liver DNA integrity and an increased ENA and EMN frequency. However, in adult eels exposed to the highest NAPH, Re liver EROD activity increase is not associated with genotoxicity. An early blood DNA damage compared to liver was observed in eels exposed to E25 and E50. The ENAs increase was also observed, though punctually in E50 and despite its obvious cytotoxicity. Liver EROD activity increased earlier in E25 than in E50. However, S is responsible for decreased liver and blood DNA integrity and an increased ENAs frequency. Genotoxicity was also observed in eels exposed to T, punctually as decreased liver and blood DNA integrity as well as a prolonged ENAs frequency increase. Liver GST activity increased at 72 hours exposure to E50 and S. A field study concerning in situ exposure of caged eels to the River Vouga water, contaminated by the pulp mill effluent, demonstrated its genotoxicity through the increased ENAs frequency at 100 and 2000 meters far from the left river bank, where the deactivated pulp mill effluent outlet was located. A liver and blood DNA integrity decrease was observed at 100 meters whereas liver EROD activity increased at 2000 meters far from the ancient sewage outlet. The environmental contaminants investigated are a serious risk to several aquatic species due to the diversity of revealed adverse effects. Therefore, the Aveiro Lagoon as well as the Coastal areas aquatic populations contaminated by the submarine sewage outlet may be subjected to the toxic effects exerted either at genetic and/or physiological level. The experimental results suggest the use of genetic and physiological test battery as a biomarker battery concerning several individual hierarchic organizational levels and applicable to various species according to different experimental designs.