Estudo do metabolismo da creatina: desenvolvimento de metodologia e avaliação da sua excreção urinária numa população pediátrica

Abstract

A creatina e creatina-fosfato desempenham funções importantes no armazenamento e transferência de fosfatos de elevada energia. Nos humanos os níveis destes compostos são mantidos por biossíntese ou via exógena. As doenças do metabolismo da creatina podem ser causadas por alterações ao nível da síntese (défice em guanidinoacetato N-metiltransferase e arginina: glicina amidinotransferase) e ao nível do transportador celular. Os défices de síntese respondem positivamente à terapia de substituição com creatina monohidratada. O quadro clínico do défice em guanidinoacetato Nmetiltransferase é caracterizado por atraso mental, epilepsia grave, alteração dos movimentos e comportamento autista e os défices em arginina: glicina amidinotransferase e transportador da creatina apresentam atrasos mental e de linguagem graves. Todos os casos diagnosticados possuem défice de creatina cerebral, detectado através da espectroscopia por ressonância magnética de protão. Este trabalho teve como objectivo a implementação de um método de cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa, para quantificação de guanidinoacetato e creatina na urina. O método utiliza um processo de derivatização com hexafluoroacetilacetona seguido de uma reacção com mono-trimetilsilil-trifluoroacetamida e o padrão interno utilizado é o ácido 2-fenilbutirico. Foram estabelecidos valores de referência para o guanidinoacetato e creatina num total de 169 amostras de urina de crianças e adolescentes saudáveis até aos 16 anos. Apesar da hereditariedade associada ao défice em transportador da creatina estar ligada ao cromossoma X este trabalho demonstrou que o sexo não influenciava a excreção do guanidinoacetato e da creatina. Foi também possível caracterizar os níveis destes compostos em função de grupos etários verificando-se que existem diferenças estatisticamente significativas entre a excreção do guanidinoacetato antes dos 4 anos e depois dessa idade.Também para a creatina há diferenças de excreção entre os grupos até aos 4 anos, dos 5 aos 11 anos e dos 12 aos 16 anos com significado estatístico. Para avaliar a aplicabilidade do método analítico implementado ao diagnóstico foi testada a urina de um doente com défice comprovado em guanidinoacetato N-metiltransferase. Os níveis de guanidinoacetato encontravam-se muito superiores ao máximo de normalidade. Foram ainda estudadas as urinas de 100 indivíduos com sintomatologia neurológica semelhante à dos défices do metabolismo da creatina. De entre este grupo encontraram-se dois indivíduos bioquimicamente compatíveis com défice em arginina: glicina amidinotransferase, dois pares de irmãos com défice em guanidinoacetato N-metiltransferase e dois com défice no transportador de creatina. No metabolismo humano a biossíntese de creatina utiliza cerca de 70 por cento da metionina total, através da S-adenosilmetionina e é limitada pela disponibilidade dos aminoácidos arginina e glicina. As dietas vegetarianas são pobres em creatina uma vez que as plantas não contêm este composto. Partindo deste pressuposto, avaliou-se a concentração de guanidinoacetato e creatina na urinas de indivíduos com erros inatos do metabolismo, sujeitos a uma dieta restrita em proteínas de origem animal. No défice em ornitina carbamoil transferase a síntese de arginina está condicionada como consequência do inadequado funcionamento do ciclo da ureia. Os níveis de guanidinoacetato e creatina, nestes pacientes, encontravam-se no limite inferior da normalidade. O segundo erro inato do metabolismo investigado foi o défice do metabolismo intracelular da vitamina B12, caracterizado por diminuição de grupos metilo devido à remetilação da homocisteína ser deficitária. Estes doentes apresentam níveis normais de guanidinoacetato e de creatina com excepção dos indivíduos mais velhos cuja creatina urinária é baixa. O último défice analisado envolve a enzima liase 3-hidroxi-3-metil-CoA e a sua influência no metabolismo da creatina é indirecto uma vez que a restrição nos aminoácidos necessários para a bissíntese da creatina é efectuada pelo baixo aporte nutricional diário. Os indivíduos com défice na 3- hidroxi-3-metilglutaril-CoA liase apresentaram concentrações baixas de guanidinoacetato nas amostras correspondentes ao momento do diagnóstico. Nestes doentes a creatina encontrava-se entre valores baixos ou no limite inferior da normalidade, independente-mente da altura da colheita. Esta parte do trabalho mostrou que os doentes com limitação na produção de aminoácidos necessários à síntese de creatina, sob regime hipoproteico, têm níveis diminuídos de creatina na urina levantando a questão de uma eventual necessidade de suplementar algumas dietas metabólicas. Conclusão: neste trabalho foi desenvolvido um método sensível de cromatografia gasosa com detecção por espectrometria de massa, para análise de défices primários e secundários do metabolismo da creatina, na população pediátrica.

The creatine/creatine-phosphate system plays an important role in storage and transmission of phosphate-bound energy. Humans maintain their creatine pool by biosynthesis and nutritional uptake. Creatine metabolism disorders so far have been described at the level of two synthetic steps, guanidinoacetate N-methyltransferase and arginine: glycine amidinotransferase, and at the level of the cellular creatine transporter 1. Creatine synthesis disorders respond positively to substitute treatment with creatine monohydrate. Guanidinoacetate N-methyltransferase deficiency is clinically characterized by mental retardation, severe epilepsy, extrapyramidal symptoms and autistic-like behavior. Arginine: glycine amidinotransferase and creatine transporter 1 pathologies present mental retardation and severe language impairment. All cases have brain creatine deficiency detected by brain proton magnetic resonance spectroscopy. This work describes a simple and sensitive gas chromatography-mass spectrometry method for quantification of guanidinoacetate and creatine in urine. This method uses a two step derivatization procedure witch involves a reaction with hexafluoroacetylacetone followed by a reaction with monotrimethylsilyl- trifluoroacetamide. 2-phenylbutyric acid is used as internal standard. To establish reference values of guanidinoacetate and creatine concentration 169 urines from healthy infants, children and adolescent were analyzed. Guanidinoacetate urinary levels were discriminated in two major groups (infants under four years and children ranging from five to 16 years of age). Creatine excretion is significatively different in infants (under four years) children (from five to eleven years) and adolescents (from twelve to 16 years). Despite the genetic inheritance of creatine transporter deficiency being linked to chromosome X, this work reports that guanidinoacetate and creatine excretion is not affected by gender. The applicability of this method is illustrated by the determination of guanidinoacetate and creatine in urine of a patient with guanidinoacetate methyltransferase deficiency. In this fluid, guanidinoacetate was highly elevated. Urine samples from 100 children with neurological symptoms were investigated to screen disorders of creatine metabolism. Two cases of arginine: glycine amidinotransferase deficiency, two pairs of siblings with guanidinoacetate N-methyltransferase deficiency and two creatine transporter deficiencies suspects are described in this study.Creatine and phosphocreatine arise from dietary sources and de novo synthesis. Vegetarian diets are pour in creatine because plants do not contain this compound. In humans, the biosynthesis of creatine accounts for about 70 percent or more of the total utilization of methionine through S-adenosilmethionine and is limited by the availability of arginine and glycine. This work also reports the analysis of guanidinoacetate and creatine excretion in three inborn errors of the metabolism treated with low protein intake. Ornithine carbamyl-transferase deficiency is characterized by arginine impairment. In these patients guanidinoacetate and creatine levels are low normal compared with normal reference range. Individuals with vitamin B12 metabolic defect lack methyl-groups due to impaired remethylation of homocysteine. Urine from these patients show normal guanidinoacetate levels but creatine excretion is low in the older cases. The 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA lyase is the last metabolic deficit investigated in this work. This deficiency indirectly influences the metabolic pathway of creatine. Analysis of urinary guanidinoacetate show low levels in the samples at the time of the diagnosis but are normal after treatment beginning and creatine concentrations in all samples are low or low normal compared to reference values. This part of the work points out that inborn errors of the metabolism under low protein diet may need to be supplemented with creatine monohydrate. In conclusion, a sensitive gas chromatography-mass spectrometry method was developed for primary and secondary creatine deficiencies diagnosis in the pediatric population.