Dental caries: a proteomic approach

Abstract

A cárie dentária é uma doença complexa que afecta uma grande parte da população mundial independentemente do sexo, idade ou etnia. Este processo é dependente de factores biológicos que se encontram presentes na saliva e placa dentária. Em seguimento do referido, amostras de saliva foram colectadas de indivíduos caracterizados em função dos índices DMFT e DMFS. A avaliação dos convencionais parâmetros clínicos como por exemplo fluxo salivar, capacidade tampão, pH usados na avaliação do risco para a cárie dentária em combinação com dieta, hábitos de higiene e tabagismo foram realizados para todos os indivíduos participantes do qual se observou a ausência de uma positiva correlação com o índice DMFT. Uma vez que os factores biológicos presentes na saliva influenciam o processo da cárie dentária, o objectivo deste trabalho consistiu na investigação de uma possível correlação entre as proteínas e peptídeos da saliva e o processo da cárie dentária. A caracterização das proteínas e peptídeos da saliva foi alcançada utilizando electroforese bidimensional (2-DE), cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) combinada com a espectrometria de massa (MS), do qual resultou a identificação de 38 proteínas das quais 12 foram identificadas pela primeira vez por 2-DE e 22 peptídeos por HPLC-MS também identificados pela primeira vez. Ensaios realizados para o estudo da composição da película dentária seguiram a mesma metodologia descrita para a caracterização das proteínas e peptídeos da saliva sendo realizados inicialmente in vitro e confi rmados posteriormente por ensaios in vivo. A adsorção dos componentes salivares à hidroxiapatite é um processo selectivo com predominância de componentes salivares de baixo peso molecular. Contudo, amilase, lactoferrina, IgA salivar e anidrase carbónica VI foram também identificadas. A extracção sequencial usando guanidina e ácido trifluoroacético das proteínas/peptídeos adsorvidas à hidroxiapatite permitiu uma avaliação da força das ligações estabelecidas. Destes ensaios verificou-se que proteínas ricas em prolina (PRP-1/3), cistatina S, statherina e histatina 1 estabeleciam interacções fortes com a hidroxiapatite permanecendo adsorvidas após extracção com guanidina. As proteínas caracterizadas da saliva e da película dentária foram correlacionadas com o índice DMFT apresentando uma predominância de elevadas quantidades de cistatinas, PRP -1/3, statherina e histatina 1 no grupo de indivíduos sem cárie. O reduzido número de fragmentos em associação com as elevadas quantidades de cistatinas podem sugerir um controle mais eficiente da actividade proteólitica evitando desta maneira a degradação de importantes proteínas salivares no grupo de indivíduos sem cárie. A composição da película dentária é afectada pela composição proteica da saliva encontrando-se as referidas proteínas em maior quantidade. Os dados obtidos sugerem uma eficiente protecção por parte das proteínas da saliva contra a cárie dentária em particular a PRP-1/3, statherina e histatina 1, provavelmente devido à sua participação nos processos de remineralização na superfície do dente, e das cistatinas na diminuição da actividade proteólitica.

Dental caries is a complex disease process that affects a large proportion of the world population, regardless of gender, age and ethnicity. This process is dependent upon biological factors that are present within saliva and dental plaque. Following this, whole saliva was collected from selected individuals characterised according its DMFT and DMFS scores. Evaluation of the conventional clinical parameters such as flow rate, buffering capacity, pH used for caries risk assessment in combination with diet, hygiene and smoke habits was performed for all participating subjects showing absence of a statistic positive correlation with DMFT index. Since biological factors present on saliva influence dental caries process, the aim of this study was to investigate how salivary proteins and peptides are correlated with this pathology. Characterisation of salivary proteins and peptides was achieved using twodimensional gel electrophoresis (2-DE) and high performance liquid chromatography (HPLC) in combination with mass spectrometry (MS) resulting in the identification of 38 proteins, being 12 proteins identified by 2-DE and 22 peptides by HPLC-MS were identified for the first time. Experiments to study enamel pellicle composition were performed following the same methodology described for salivary proteins and peptides, initially in vitro being supported with in vivo assays. Adsorption of salivary components to hydroxyapatite showed to be a selective process with a predominance of low molecular weight salivary components. However, amylase, lactoferrin, S-IgA, carbonic anhydrase VI were also identified. A sequential extraction, using of guanidine and trifluoroacetic acid, of the adsorbed proteins/peptides to hydroxyapatite allowed to evaluate the strength of the establish interactions. From this experiments, proline-rich proteins (PRP -1/3), cystatin S, statherin, histatin 1 exhibited a strong interaction with hydroxyapatite remaining adsorbed after guanidine extraction. Characterised salivary proteins from whole saliva and enamel pellicle were correlated with DMFT index showing a predominance of higher amounts of cystatins, PRP-1/3, statherin and histatin 1 in caries free group. Decreased number of fragments in association with higher amounts of cystatins may suggest a more effective control in proteolytic activity which avoid the degradation of important salivary proteins from caries free group. Acquired pellicle composition is affected by whole saliva protein composition being the above referred proteins present in higher amounts. Obtained data suggest an effective protective role of several salivary proteins to dental caries in particular of PRP-1/3, statherin and histatin 1, possibly due to their participation on remineralization processes at the tooth surface, and of cystatins probably by decreasing proteolytic activity.