Inibição da replicação do vírus da imunodeficiência humana por anticorpos intracelulares de domínio único VH derivados de coelho

Abstract

O Vif (Factor de Infecciosidade Viral) é uma proteína acessória do Vírus da Imunodeficiência Humana (VIH) cuja função principal é bloquear a acção do Apobec3G, uma citidina deaminase que tem a capacidade de tornar o VIH-1 não infeccioso através da indução de hipermutações G para A durante a síntese do ADN viral. Recentemente desenvolvemos anticorpos recombinantes de cadeia única (scFv) específicos contra o Vif, a partir da construção de uma biblioteca genómica de anticorpos resultantes da imunização de coelhos. Os anticorpos foram expressos no citoplasma celular, mantiveram a sua capacidade de ligação ao Vif e inibiram a replicação do VIH-1. Estes resultados sugerem que este tipo de estratégias de terapia génica poderão vir a ter bastante sucesso no tratamento de doenças infecciosas. No entanto, esta nova forma de terapia por imunização intracelular, apresenta ainda alguns obstáculos. A expressão intracelular dos anticorpos no ambiente redutor do citoplasma é normalmente confrontada com problemas de folding, diminuição da solubilidade, níveis de expressão e tempo de meia vida. Neste contexto, o objectivo desta dissertação foi o desenvolvimento de anticorpos de domínio único VH anti-Vif de coelho mais pequenos e robustos. A abordagem efectuada para construir estes anticorpos intracelulares foi baseada nas características dos anticorpos de cadeia pesada dos camelos (VHH). Os domínios VHH apresentam naturalmente solubilidades e estabilidades elevadas em consequência de substituições específicas de aminoácidos (Phe- 37, Glu-44, Arg-45, Gly-47 e Arg103) na região correspondente à interacção com o domínio VL. Desta forma, neste estudo para aumentar a solubilidade e estabilidade do domínio VH anti-Vif, os aminoácidos hidrofóbicos da região de interface foram substituídos por aminoácidos hidrofílicos dos VHH. Os resultados obtidos indicaram que na ausência do domínio parental VL, todos os VHs em estudo apresentaram um reconhecimento específico da proteína Vif . No entanto, somente os VHs mais camelizados é que apresentaram níveis altos de expressão intracelular. O processo de camelização desenvolvido no domínio VH anti-Vif demonstrou ter um papel importante no aumento do tempo de meia vida intracelular. Os resultados apresentados mostram uma excelente correlação entre o aumento da solubilidade e estabilidade do domínio VH, com o aumento da camelização. A actividade biológica de cada um dos domínios VH demonstrou estar fortemente relacionada com a solubilidade e estabilidade da proteína. Os VHs mais camelizados interferem na transcrição reversa e integração do ADN viral, inibindo a replicação. Esta inibição demostrou estar associada com o aumento dos níveis de expressão do Apobec3G. O presente estudo sugere assim que a camelização de domínios VH derivados de coelho poderá ser uma abordagem bastante promissora para o desenvolvimento anticorpos intracelulares cada vez mais pequenos e robustos para futuras aplicações a nível da terapia génica.

The Vif Protein (Viral Infectivity Factor) is an accessory protein of Human Immunodeficiency Virus (HIV), whose main function is to block the antiviral activity of Apobec3G; a cytidine deaminase that induces G to A hypermutation in newly synthesized viral DNA. We recently developed a specific single-chain antibody (scFv) from immunized rabbits to HIV-1 Vif protein that was expressed intracellularly and inhibited reverse transcription and viral replication. These results suggest that this kind of gene therapy approaches may have particular promise in treatment of infected diseases. However, in the reducing environment of the cytoplasm, the intracellular expression of antibodies is normally confronted with folding problems, decreased in solubility, expression levels and half-life of protein. Within this context, our goal was to develop small and robust anti-Vif VH single-domains antibodies derived from rabbits. The strategy to develop this intracellular antibodies where based in camelid antibody domains (VHH). VHH single-domains have naturally high solubility and stability due to specific amino acid substitutions in interface region (Phe37, Glu44, Arg45, Gly47 and W103R). In order to improve the anti-Vif VH solubility and stability required for making these molecules potential intrabodies, we mutated the exposed hydrophobic surface area contacting the VL domain. Our results demonstrate that all constructed anti-Vif VH single-domains preserve the antigen-binding activity and specificity in the absence of the parent VL domain. However, only the most highly camelized domains had high levels of intracellular expression. The expression in eukaryotic cells showed that VH single-domains could correctly fold as soluble proteins in the reducing environment. The results demonstrated an excellent correlation between improvements in protein solubility with gradual increasing camelization. Camelized single-domains efficiently bound Vif protein and neutralized its infectivity enhancing function, by reducing late reverse transcripts and proviral integration. Moreover, cell specificity of anti-Vif intrabodies was correlated with an increase of Apobec3G. The present study strongly suggests that camelization of rabbit VH domains is a potentially useful approach for engineering intrabodies for gene therapy.