Microbiome of Pinus pinaster

Abstract

Pinus pinaster has a great environmental, historical and economical importance to Portugal. It represents the third place in occupation in forestry area. However, it has been losing area due to the modifications on land use, fires and diseases such as the pine wilt disease (PWD). Native from the North America the PWD has been spreading worldwide, it has spread through Asia and more recently was identified in Europe being detected in Portugal in 1999, representing a major threat to forests. Recently, the importance of the bacteria community to the PWD has been accessed and few studies address the microbiome of P. pinaster. Most of the existing studies uses culture-dependent techniques. This work aimed to reveal the bacterial community of healthy P. pinaster trees using culture-independent techniques. To observe the bacterial communities of healthy P. pinaster, stem samples from trees aged between 20 and 30 years were collected from 4 Portuguese locations: Comporta, Góis, Madeira Island and Vouzela. The trunks were cut into disks and the sawdust of the center of these disks were used to extract DNA. Samples were tested for the presence of the PWD nematode and all were negative. DGGE analysis was performed to compare the bacterial community of different samples and pyrosequencing was used to identify the community. After analyzing the DGGE profiles, a sample was cloned and sequenced, and the results showed that the most common and intense bands belonged to chloroplast genetic material. Pyrosequencing results had a great amount of reads belonging to chloroplast and they were eliminated from the study. With the pyrosequencing, six plyla were detected: Proteobacteria, Acidobacteria, Firmicutes, Bacteriodetes, Armatimonadetes and Actinobacteria. Proteobacteria was the most common, and from this plylum, Gammaproteobacteria was the most abundant class. Samples grouped by location and the location community differ significantly, only two OTUs were shared by all locations. Despite the low read number the bacterial community was characterized, and this information can be used for future studies.

Pinus pinaster possui uma grande importância ambiental, histórica e económica em Portugal, conquistando o terceiro lugar em ocupação florestal. Entretanto sua área está a diminuir devido a modificações na utilização dos terrenos, fogos e doenças como a da murchidão do pinheiro (DMP). Nativa da América do Norte, a DMP vem se espalhando em uma escala global, já está presente na Ásia e mais recentemente na Europa, sendo detectada em 1999 em Portugal, representando assim uma ameaça a florestas do mundo inteiro. Existem evidências que apontam para a importância da comunidade bacteriana no desenvolvimento da DMP e poucos estudos abordam o microbioma do P. pinaster, com a maioria utilizando metodologias baseadas em cultivo. Este trabalho tem como objetivo revelar a comunidade bacteriana de árvores de P. pinaster saudáveis utilizando técnicas independentes de cultivo. Para observar a comunidade bacteriana do P. Pinaster saudável, árvores entre 20 e 30 anos de idade foram recolhida de 4 localidades portuguesas: Comporta, Góis, Ilha da Madeira e Vouzela. O tronco dessas árvores foi cortado em discos e o serrim do centro desses discos foi utilizado para extração de DNA. Todas as amostras foram testadas para a presença do nemátodo sendo que este estava ausente em todas as amostras. Foi feito DGGE com o objectivo de comparar a comunidade bacteriana de diferentes amostras, e esta foi identificada utilizando-se pirosequenciação. Tendo em conta os perfis de DGGE, foi feita a clonagem e sequenciação de uma das amostras, e verificou-se que as bandas mais intensas, e presentes em todas as amostras, eram material genético proveniente de cloroplastos. Os resultados de pirosequenciação revelaram uma grande quantidade de reads proveniente de cloroplastos que foram eliminadas do estudo. A análise dos resultados da pirosequenciação permitiu identificar seis filos: Proteobacteria, Acidobacteria, Firmicutes, Bacteriodetes, Armatimonadetes e Actinobacteria. Proteobacteria foi o filo mais comum e dele Gammaproteobacteria foi a classe mais abundante. As amostras se agruparam de acordo com o local de origem e as comunidades dos locais se diferenciavam significativamente. Apenas duas OTUs eram compartilhadas por todos os locais. Apesar do baixo número de reads, a estrutura da comunidade bacteriana foi caracterizada e essa informação pode ser agora utilizada em futuros estudos.